【摘 要】
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背景F1抗原是一种鼠疫杆菌荚膜抗原,具有抗吞作用,是鼠疫耶尔森菌重要的毒力成分,也是该菌的保护性抗原,介导多种免疫应答反映[1]。F1抗原常作为鼠疫检测标志物,同时也应用于鼠疫亚单位疫苗的制备,具有非常高的生物学价值[2]。本实验室已于前期实验中成功免疫融合得到可分泌鼠源抗f1抗体的4c6杂交瘤细胞,并在小鼠体内成功表达,通过提纯小鼠腹水获得鼠源F1抗体。目的分别构建用于合成人源化抗鼠疫f1抗体轻
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背景F1抗原是一种鼠疫杆菌荚膜抗原,具有抗吞作用,是鼠疫耶尔森菌重要的毒力成分,也是该菌的保护性抗原,介导多种免疫应答反映[1]。F1抗原常作为鼠疫检测标志物,同时也应用于鼠疫亚单位疫苗的制备,具有非常高的生物学价值[2]。本实验室已于前期实验中成功免疫融合得到可分泌鼠源抗f1抗体的4c6杂交瘤细胞,并在小鼠体内成功表达,通过提纯小鼠腹水获得鼠源F1抗体。目的分别构建用于合成人源化抗鼠疫f1抗体轻重链的质粒p MH3-f1-4c6-κ与p MH3-f1-4c6-H,将两种质粒转染入CHO-s细胞中,建立稳定高表达转染细胞系,扩大培养合成并纯化得到人源化抗鼠疫F1抗原抗体,鉴定其活性。为临床治疗急性鼠疫提供治疗方案及用药思路。方法裂解4c6杂交瘤细胞并提取该细胞全m RNA,逆转录得到c DNA。通过PCR分别合成F1鼠源性抗体的目的基因轻重链条带,将两条带测序后分别进行人源化并转入p MH3质粒,将质粒共同转染入CHO-s细胞中,筛选稳定高表达细胞系,扩大培养后,从培养液中提取并纯化抗体。使用F1抗原包被酶标板,将人源抗体从1:200浓度开始倍比稀释后加入酶标板,37℃孵育1小时后洗涤加入HRP染色的抗人Fc段抗体,继续于37℃孵育1小时后洗涤后显色,测定OD450值,通过该ELISA检测F1嵌合抗体与F1抗原特异性结合。在酶标板中以1:2000浓度加入f1-4c6鼠源抗体孵育1小时,将人源抗体从1:50浓度开始被比稀释后加入酶标板孵育,加入Hrp染色的抗人Fc段抗体孵育后显色,测定OD450值,通过该竞争性ELISA比较鼠源抗体及人源抗体与F1抗原亲和性。经过大分子相互作用分析检测人源及鼠源抗体与F1抗原的免疫亲和力,对与抗体结合的抗原进行质谱分析。结果成功合成F1抗体轻重链质粒p MH3-f1-4c6-κ与p MH3-f1-4c6-H,转染入CHO-s细胞中建立稳定高表达细胞系CHMIg G-F14c6-5,大量培养后纯化得到抗体,经过dotblot与elisa检测其为人源化抗F1抗原抗体,通过竞争性elisa检测法证明人源抗体可以竞争掉鼠源抗体与抗原的结合位点。通过亲和力检测验证该抗体与F1抗原有较高亲和力,对结合蛋白进行质谱分析证明该蛋白为F1抗原。结论制备了大量人源化f1嵌合抗体,为后续动物实验及临床应用做了准备。
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