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目的： 研究miRNA-34a在脊髓损伤中作用及机制，以及miRNA-34a在悬灸督脉穴治疗脊髓损伤后的表达变化，进一步研究悬灸督脉穴治疗脊髓损伤的作用机制。 方法： 本课题分两部分开展研究。第一部分研究miRNA-34a在脊髓损伤中的作用和机制:研究一，先通过热图，筛查脊髓损伤后1日和3日时间节点上受损脊髓组织中表达发生显著改变的miRNA，并对前六种表达显著改变的miRNA进行QRT-PCR验证;研究二，以SD大鼠为研究对象，随机分为SCI组、SCI+miRNA-34a inhibitor组和SCI+miRNA-34a mimics组，通过BBB评分评价miRNA-34a对SCI大鼠后肢运动功能的影响，采用Cresyl violet staining和TUNEL技术分别检测miRNA-34a对SCI大鼠脊髓细胞存活占比、脊髓细胞凋亡的影响，采用Western Blot技术检测miRNA-34a对SCI大鼠脊髓细胞中凋亡相关蛋白caspase3、caspase9、PARP、Bcl-2表达变化的影响;研究三，以BV-2细胞为研究对象，通过H2O2诱导BV-2细胞构建SCI细胞模型，采用MTT和Annexin V-FITC-PI技术分别检测H2O2诱导下BV-2细胞的生长活力、凋亡改变，应用QRT-PCR技术检测miRNA-34a在100μMH2O2诱导的BV-2细胞中的表达变化，及BV-2细胞中miRNA-34a表达变化与100μMH2O2持续诱导时间之间的关系，并探究100μM、200μM、400μM不同浓度H2O2诱导的BV-2细胞中miRNA-34a的表达变化规律，在构建SCI细胞模型的基础上，应用WesternBlot技术在SCI细胞模型中进一步检测验证miRNA-34a对caspase3、caspase9、PARP、Bcl-2表达的调控作用，应用MTT和Annexin V-FITC-PI技术分别检测SCI细胞模型中miRNA-34a对脊髓细胞生长活力、细胞凋亡的影响;研究四，以BV-2细胞为研究对象，mimic NC、inhibitor NC、miR-34a inhibitor、miR-34a mimic不同基因质粒共转染BV-2细胞，通过Dual luciferase reporter assay技术检测miRNA-34a对Bcl-2的靶向调控作用，应用Western Blot和QRT-PCR技术做进一步验证。第二部分，基于miRNA-34a研究悬灸督脉穴对脊髓损伤的作用和机制，以SD大鼠为研究对象，随机分为正常组（N组）、假手术组（S组）、SCI组(M组)和悬灸大椎穴组(T1组)、悬灸命门穴组(T2)、悬灸后会穴组(T3)，通过BBB评分评价各组SCI大鼠后肢运动功能，应用Western Blot和QRT-PCR检测各组大鼠T9-T11节段脊髓组织中miRNA-34a表达变化，同时，检测了各组大鼠T9-T11节段脊髓组织中P53、c-fos、P27kip1、Bcl-2、PPAR-γ、ERK1/2、TRPV1的表达变化。 结果： 在第一部分研究中，研究一结果发现，miR-337，miR-380-3p，miR-218，miRNA-34a，miR-451和miR-486-5是脊髓损伤后1日、3日时间节点上，表达变化最为显著的前6种miRNA，在6种miRNA中，以miRNA-34a的表达变化最为显著;研究二BBB评分结果发现，与SCI组比较，SCI+miRNA-34a inhibitor组在实验第7、14、21、28日的BBB评分差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），SCI+miRNA-34a mimics组实验第7、14、21、28日的BBB评分差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)，与SCI组比较，SCI+miRNA-34a inhibitor组受损脊髓节段脊髓细胞在实验第1日凋亡减弱(P＜0.05),第3日凋亡显著减弱(P＜0.01)，SCI+miRNA-34a mimics组受损脊髓节段脊髓细胞在实验第1日和第3日凋亡均加剧(P＜0.05)，Western Blot结果发现，SCI+miRNA-34a inhibitor组SCI大鼠受损脊髓组织中凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、PARP的表达水平均低于SCI组，而Bcl-2表达水平高于SCI组，SCI+miRNA-34a inhibitor组SCI大鼠受损脊髓组织中凋亡细胞所占比例显著低于SCI组和SCI+mimics组(P＜0.05);研究三MTT结果发现，与control组比较，H2O2组中BV-2细胞在H2O2诱导后，细胞活力减弱，在实验第16h时出现明显差异(P＜0.05)，第24、48小时差距加大(P＜0.01)，QRT-PCR结果发现，H2O2诱导下，BV-2细胞中miRNA-34a的表达水平在实验2h后出现上调，在16h达到峰值，在100-400μM不同浓度H2O2诱导下，BV-2细胞中miRNA-34a的表达水平呈剂量依赖性增高趋势，H2O2诱导下的BV-2细胞在miRNA-34a inhibitor转染BV-2细胞后，凋亡显著减少(P＜0.01)，细胞活力显著恢复(P＜0.01)，但仍低于control组BV-2细胞活力(P＜0.05)，Western Blot结果发现，H2O2+miRNA-34a inhibitor组中凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、PARP的表达水平均显著低于H2O2组(P＜0.01)，而Bcl-2的表达水平显著高于H2O2组(P＜0.01);研究四通过TargetScan和PicTar生物学分析发现miRNA-34a与Bcl-2序列之间的潜在结合位点AAUGUGA-UUACACU，应用Dual luciferase reporterassay技术检测发现miRNA-34a inhibitor组中BV-2细胞中野生型Bcl-2基因质粒pGL3-Bcl-23UTR wt活性增强，而重组基因质粒pGL3-Bcl-23UTR Mut无明显改变，miRNA-34a mimic组中BV-2细胞中pGL3-Bcl-23UTR wt活性降低，pGL3-Bcl-23UTR Mut无明显改变，Western Blot和QRT-PCR结果均表明，miRNA-34a inhibitor使BV-2细胞中Bcl-2的表达增加(P＜0.01)，miRNA-34amimics使BV-2细胞中Bcl-2的表达降低(P＜0.01)。在第二部分研究中，BBB评分显示，悬灸治疗首日、第7日、第14日M、T1、T2、T3四组BBB评分两两比较，差异不显著(P＞0.05)，第21日BBB评分结果显示，M、T1、T2、T3四组中T2组BBB评分最高，T2组分别与M组、T1组、T3组进行两两比较，BBB评分差异均有统计学意义(P＜0.01)，M、T1、T3三组间两两比较差异均无统计学意义(P＞0.05);Western Blot和QRT-PCR结果均表明，与M组比较，T1组、T2组、T3组中P53、miRNA-34a、Bcl-2、PPAR-γ的蛋白和基因表达均增加(P＜0.01)，而c-fos、TRPV1、ERK1/2、P27klp1的蛋白和基因表达均降低(P＜0.01);T1组、T2组、T3组三组间两两比较，Western Blot结果显示，与T1组比较，T2组P53、P27kip1表达降低(P＜0.01)，ERE1/2表达降低(P＜0.05)，Bcl-2、c-fos、PPAR-γ、TRPV1表达升高(P＜0.01)，T3组ERE1/2、TRPV1表达降低(P＜0.01)，Bcl-2、PPAR-γ表达升高(P＜0.01)，与T2组比较，T3组Bcl-2、c-fos表达降低(P＜0.05)、ERK1/2、TRPV1表达降低(P＜0.01)，P27kip1、P53表达升高(P＜0.05)，PPAR-γ、Bcl-2的表达升高(P＜0.01)，QRT-PCR结果显示，与T1组比较，T2组miRNA-34amRNA、ERK1/2mRNA、P27kip1 mRNA表达降低(P＜0.01)，TRPV1 mRNA表达升高(P＜0.01)，T3组miRNA-34a mRNA、ERK1/2mRNA、TRPV1 mRNA表达降低(P＜0.01)，P27kip1 mRNA表达降低(P＜0.05)，Bcl-2 mRNA表达升高(P＜0.01)，PPAR-γ mRNA表达升高(P＜0.05)，与T2组比较，T3组Bcl-2mRNA、TRPV1 mRNA表达降低(P＜0.01)，PPAR-γ mRNA表达升高(P＜0.01)。 结论： 1.miRNA-34a是脊髓损伤后1日和3日时间节点上SCI相关基因热图中最为失调的miRNA，其对脊髓损伤的作用与caspase-3、caspase-9、PARP、Bcl-2密切相关，miRNA-34a抑制剂可通过靶向BV-2细胞中的Bcl-2来发挥抗凋亡作用，脊髓损伤早期抑制miRNA-34a可能是促进脊髓损伤后神经修复的重要策略。 2.悬灸脊髓损伤大鼠督脉大椎穴、命门穴、后会穴均对损伤脊髓组织中的miRNA-34a有调节作用，同时影响脊髓P53、Bcl-2、c-fos、ERK1/2、P27kip1、PPAR-γ、TRPV1的表达。 3.悬灸督脉命门穴能改善脊髓损伤大鼠后肢运动功能，该作用可能与其上调受损脊髓Bcl-2、PPAR-γ表达，下调受损脊髓c-fos、ERK1/2、P27kip1表达有关。