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目的通过体外实验研究白血病儿童骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的生物学特性及其免疫调节作用,从而探讨白血病儿童骨髓来源的MSCs在白血病儿童化疗后实行自体回输的可行性及可能出现的免疫重建作用。方法通过Ficoll-Hypaque梯度密度离心法分离出白血病儿童骨髓单个核细胞,贴壁法体外纯化扩增MSCs,获得第3～4(P3~4)代细胞用于实验。光镜观察细胞生长形态,瑞氏染色观察细胞核浆比例及形态,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测免疫表型,油红O染色及茜素红染色检测其向脂肪及骨细胞分化等观察其生物学特性。取外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PB-MNCs),用植物凝集素(PHA)及白细胞介素2(IL-2)进行刺激后将MSCs按照不同比例(1/5~1/1000)加入MNCs中,进行细胞相互接触的共培养、transwell体系的细胞非接触性共培养,在培养第5天后收集悬浮细胞,用LDH法检测各组中MNCs的增殖情况,用ELISA方法检测单独MNCs、加入不同比例的MSCs与MNCs接触共培养体系中各组干扰素-γ(IFN-γ)和穿孔素(perforin)的分泌情况,再用流式细胞术分析单独MNCs、不同比例MSCs∶MNCs接触共培养体系中T细胞亚群CD3、CD4、CD8及调节性T细胞CD4、CD25的免疫表型表达情况。结果白血病儿童骨髓来源的MSCs在光镜下观察,呈梭形,并平行排列成漩涡状生长,瑞氏染色可见其胞核较大,细胞传代后3d内处于潜伏期,3d后进入生长期,8d后进入平台期。MSCs表达CD29、CD105、CD13,不表达CD34、CD45、HLA-DR、CD14。在相应的诱导条件下,可以向脂肪及骨细胞分化,油红0染色及茜素红染色呈阳性。在MSCs与MNCs细胞相互接触共培养体系中,当MSCs∶MNCs>1∶100时,MSCs能抑制PHA和IL-2刺激的MNCs的增殖,随MSCs数量增加,抑制作用更加明显;随MSCs数量减少,MSCs对PHA和IL-2刺激的MNCs的增殖抑制作用减弱,当MSCs∶MNCs≤1∶100时,MSCs在一定程度上可促进MNCs的增殖;而Transwell非接触性共培养体系中发现,MSCs能够促进MNCs的增殖。MSCs与MNCs不同比例共接触培养后检测IFN-γ及perforin的分泌,MSCs:MNCs=1:10时对细胞因子的分泌与受IL-2+PHA刺激后单独MNCs培养相比明显下降。检测接触共培养体系中淋巴细胞亚群比例改变结果显示,各组CD3+CD4+比例无明显改变;当MSCs∶MNCs>1∶100时,CD3+CD8+比例减少,CD4+CD25+hi比例升高;而当MSCs∶MNCs=1∶1000时,CD3+CD4+ ,CD3+CD8+,CD4+CD25+hi比例与单独MNCs培养时比例无明显差异。结论①白血病患儿骨髓培养出的贴壁细胞是MSCs,骨髓含量在1ml以上且方法得当可以培养出MSCs。②初诊的白血病患儿的骨髓相对容易培养出骨髓MSCs,且在体外扩增速度较快。③白血病儿童来源的MSCs具有MSCs的共同生物学特性。④MSCs在体外对MNCs增殖的影响具有两面性,而且呈剂量依赖性。在一定比例内(本研究MSCs:MNCs>1:100时),MSCs对MNCs增殖的抑制作用随着MSCs加入的浓度升高而增强;当MSCs与MNCs小于一定比例(本研究MSCs:MNCs≤1:100)时,MSCs的抑制作用减少,有可能促进MNCs的增殖。⑤在MNCs与MSCs的接触共培养体系中,MSCs可以抑制PHA作用下MNCs中免疫效应细胞分泌IFN-γ、perforin ( P < 0. 05) ,当MSCs与MNCs的比例小到一定程度时,抑制作用消失。⑥MSCs可以影响与MSCs接触共培养的MNCs中的淋巴细胞亚群比例,下调CD8+细胞的比例而上调CD4+CD25+hiT细胞比例,呈剂量依赖性的。