研究背景糖尿病（diabetes mellitus, DM）是由遗传和环境因素相互作用引起的一组以糖代谢紊乱为主要表现的临床综合征。随着全球经济发展、人口老年化和人民生活水平的改善,全球范围内DM患病率逐年上升,截止2010年DM患者达2.8亿,预计2030年将达到4.3亿。糖尿病已成为患病率、致残率及死亡率仅次于肿瘤和心血管疾病的第三大慢性非传染性疾病。糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是DM特异性微血管并发症,也是DM患者常见的慢性并发症之一。据统计,30%-40%的1型糖尿病（type1diabetes,T1DM）患者有糖尿病肾损害,而2型糖尿病（type2diabetes,T2DM）患者中也约有20%发生DN。DN的特点之一是一旦出现肾功能损害,其进展速度往往远快于非DN,乃至发展成终末期肾病（end stage renal disease,ESRD）,需要进行透析治疗或肾移植。随着DM患病率的增加,DN已成为欧美国家ESRD的首位原因,在我国ESRD的病因中也高居第2位。临床观察发现,DN发展至ESRD时,无论给予透析治疗还是肾移植,患者的远期预后均比其它肾脏疾病患者差,这类患者常合并心血管并发症,死亡率高。因此,DN已成为影响人类健康的一个重大问题。DN的基本病理改变为肾小球系膜细胞增殖和系膜区细胞外基质增多、肾小球毛细血管基底膜增厚和毛细血管通透性增高、足细胞损害和数量减少、肾小管肥大、肾小管基底膜增厚与分层,以及出入球小动脉透明变性和动脉硬化,伴随蛋白尿的出现,进一步加剧肾小球硬化和肾小管间质纤维化,最终进展为ESRD。DN的发病机制极其复杂,至今尚未完全阐明。目前认为DN是肾脏血流动力学改变、糖脂代谢紊乱、氧化应激、多种细胞因子、胰岛素抵抗和遗传因素共同作用的结果。在DN的发生发展过程中,肾小球血流动力学改变、细胞增殖、细胞肥大等诸多方面,均有细胞因子的参与。种类繁多的细胞因子通过自分泌、旁分泌和内分泌途径发挥作用,它们相互影响、相互制约,构成了DN发病过程中复杂的细胞因子网络,在DN发病机制中发挥着重要作用。生长分化因子-15（GDF-15）,是转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员的一个远支。GDF-15是由巨噬细胞在多种病理及环境应激情况下活化表达的产物,巨噬细胞激活后通过分泌TNF-α上调GDF-15的表达,而GDF-15负反馈抑制巨噬细胞活化产生TNF-α等细胞因子,故又称巨噬细胞抑制因子-1（MIC-1）,是一种应激反应蛋白,在体内发挥广泛的保护性调节作用。利用基因芯片技术发现,在糖尿病动物模型肾损害的早期（7天）,GDF-15作为其中主要的调节因子之一即有表达的明显上调。另有基础研究发现,在1型和2型糖尿病动物模型中,GDF-15基因敲除小鼠较野生型小鼠肾损害重。目前,GDF-15作为一种新型心血管保护因子,引起了人们的广泛关注,GDF-15水平与多种心血管疾病（心力衰竭、急性冠脉综合征及动脉粥样硬化）的诊断、危险分层和预后判断有密切关系。在T2DM中,患者血循环中GDF-15水平较健康对照者明显升高。国外少量前瞻性研究发现：GDF-15不仅是1型糖尿病肾病患者全因死亡率及心血管疾病死亡率的良好预测指标,还能预测2型糖尿病患者尿蛋白增多的风险。但是,血浆GDF-15在2型糖尿病肾病不同临床分期中的表达水平及其变化的临床研究甚少。血管内皮生长因子（VEGF）,是一种选择性作用于内皮细胞的生长因子,在肾脏中主要是由足细胞和肾小管上皮细胞分泌。其生物学特性是增加血管通透性、促进血管生成及增加黏附分子产生等。在生理情况下,足细胞分泌的少量VEGF具有维持内皮窗孔的功能,适量的VEGF能保护和修复肾小球内皮细胞。高血糖、血管紧张素Ⅱ、TGF-β及晚期糖基化终末产物（AGE）均能诱导足细胞过表达VEGF。过量的VEGF则可降低肾小球内皮细胞电阻、增加内皮细胞通透性,导致蛋白尿的产生,促进多种致纤维因子分泌、诱发细胞外基质沉积、肾小管基底膜增厚和肾间质纤维化,促成肾小球硬化,从而在DN发病中发挥重要作用。动物模型中阻断VEGF可有效改善DN、减轻蛋白尿,而大量临床研究表明DN患者血浆VEGF水平随着肾病进展有不同程度的提高。内皮抑素（ES）,是VEGF的拮抗因子,两者是目前抑制血管生成和促进血管生成生物效应最强的一对因子。ES可在多个环节抑制VEGF介导的促血管生成和促血管通透效应。动物模型中,糖尿病大鼠的血浆及肾组织中ES和VEGF表达增加,两者的表达量均与糖尿病肾损害严重程度呈显著正相关,血浆中VEGF和ES也具有显著正相关性。有文献报道,慢性肾脏疾病患者、糖尿病视网膜病变患者的血浆ES水平均较健康对照者明显升高,但未见探讨DN患者血浆ES水平变化的研究报道。且同时探讨VEGF、ES这两个细胞因子在2型糖尿病肾病患者体内的表达水平、两者与DN关系的临床研究甚少。研究目的1.本研究第一部分应用ELISA法,检测血浆GDF-15在2型糖尿病肾病不同临床分期中的表达水平及其变化,并分析GDF-15与尿微量白蛋白（mAlb）、估算的肾小球滤过率（eGFR）等反映糖尿病肾损害严重程度的临床指标之间的关系,旨在初步探讨GDF-15在2型糖尿病肾病诊断、病情评估中的临床应用价值。2.本研究第二部分应用ELISA法,检测血浆VEGF、ES在2型糖尿病肾病不同Mogensen分期中的表达水平及其变化,并分析两者在DN不同临床分期中的相互关系,旨在探讨VEGF、ES与DN发生发展以及各临床指标之间的关系及其临床意义。具体研究内容分为以下两个部分：第一章生长分化因子-15在2型糖尿病肾病患者血浆中的表达水平及其临床意义[目的]探讨生长分化因子-15在2型糖尿病肾病患者血浆中的表达水平及其临床意义。[方法]1.研究对象2型糖尿病及2型糖尿病肾病患者（自2013年6月至2013年9月,从南方医院内分泌代谢科住院患者中收集）。入选标准（1）30-75周岁；（2）符合1999年WHO （Word Health Organization,WHO）的2型糖尿病诊断和分型标准；（3）受试者知情同意参加试验。排除标准：（1）特殊类型的糖尿病；（2）近1个月内发生糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷等急性并发症；（3）近1月内有脑梗塞或TIA病史者；（4）冠心病（ECG、临床表现及病史）、急慢性心功能不全；（5）血ALT、AST大于等于正常值上限2倍；（6）发热、急性感染及手术等应激情况下患者；（7）有肿瘤病史者：（8）有泌尿系感染或糖尿病肾病以外肾脏疾病的患者；（9）已行透析治疗或肾移植患者。2.研究方法：2.1根据Mogensen分期标准,分为：（1）正常蛋白尿组（A组）30例,mAlb<30mg/24h;（2）微量蛋白尿组（B组）20例,30mg/24h≤mAlb<300mg/24h;（3）大量蛋白尿组（C组）30例,mAlb≥300mg/24h。各组在年龄、性别及体重指数（BMI）方面均匹配。2.2根据患者年龄、性别和肌酐值,采用CKD-EPI公式计算肾小球滤过率,即估算的肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate, eGFR）。按eGFR≥90ml/min/1.73m2、60≤eGFR<90ml/min/1.73m2、eGFR<60ml/min/1.73m2将所有研究对象分为肾功能正常组（D组）、肾功能轻度受损组（E组）和慢性。肾功能不全组（F组）三个亚组,各组的样本量分别为31、26和23,在年龄、性别及BMI方面均匹配。2.3采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测各组患者血浆中GDF-15的浓度,并收集整理所有研究对象的临床资料和实验室数据。3.统计学分析：采用SPSS19.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差表示,非正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）表示。率的比较采用x2检验；两两比较采用独立样本t检验或Mann-Whitney U检验；多组间资料比较采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis单因素方差分析。GDF-15与常见临床指标的相互关系采用偏相关分析。采用受试者工作特征（ROC）曲线,分析mAlb及GDF-15诊断肾功能受损（即eGFR<90ml/min/1.73m2）的有效性。最后以mAlb为因变量、GDF-15及其它临床指标为自变量进行多元线性回归分析。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1.正常蛋白尿组和微量蛋白尿组的GDF-15水平分别为704.5（548.8-975.8）pg/ml、864.0（636.1-994.3） pg/ml,均低于大量蛋白尿组[1773.9（1099.1-2357.4）pg/ml]（P均<0.01）；正常蛋白尿组GDF-15水平低于微量蛋白尿组（P>0.05）。2.肾功能正常组和肾功能轻度受损组的GDF-15水平分别为752.2±340.9pg/ml、1399.5±1145.1pg/ml,均低于慢性肾功能不全组（2184.1±1673.8pg/ml）（P<0.01,P<0.05）;肾功能正常组GDF-15水平低于肾功能轻度受损组（P<0.01）。3.偏相关分析显示,血浆GDF-15与糖尿病病程、mAlb、尿素氮（BUN）及肌酐（sCr）呈显著正相关（r=0.246,0.493,0.390,0.471,P均<0.05）,与eGFR及血浆白蛋白（Alb）呈显著负相关（r=-0.438,-0.397,P均<0.01）。4.以mAlb为因变量进行多元线性回归分析,得到的回归方程为mAlb=-2675.46+19.18SBP+0.49GDF₁5,显示：GDF-15与mAlb水平具有独立相关性。5.在对肾功能下降（eGFR<90ml/min/1.73m2）的诊断中,GDF-15和mAlb的曲线下面积分别为0.801和0.717,GDF-15曲线下面积大于mAlb（P<0.05）。当733.78pg/ml作为GDF-15诊断肾功能受损的临界值时,敏感性和特异性达到最佳,分别为88.1%和58.1%。[结论]1.GDF-15在2型糖尿病肾病患者血浆中的表达量随着肾病进展逐渐增多,与目前反映肾损害的经典临床指标（mAlb、eGFR、BUN及sCr）存在显著的相关性,且与mAlb水平独立相关,可反映肾病严重程度；GDF-15有望成为评估2型糖尿病肾病肾损害严重程度的一种新的血液学标志物。2.GDF-15浓度在肾功能轻度受损（eGFR<90ml/min/1.73m2）时即有显著性升高,且随着eGFR的下降而逐渐升高；另外,在对肾功能下降（eGFR<90ml/min/1.73m2）的诊断中,GDF-15曲线下面积大于mAlb;GDF-15有望成为早期诊断2型糖尿病肾病的一种新的血液学标志物。第二章血管内皮生长因子和内皮抑素与2型糖尿病肾病的关系研究[目的]探讨血管内皮生长因子（VEGF）和内皮抑素（ES）与2型糖尿病肾病的关系。[方法]1.研究对象、入选标准及排除标准同第一章。2.实验方法：根据Mogensen分期标准,分为：（1）正常蛋白尿组（A组）30例,mAlb<30mg/24h;（2）微量蛋白尿组（B组）20例,30mg/24h≤mAlb<300mg/24h;（3）大量蛋白尿组（C组）30例,mAlb≥300mg/24h。各组在年龄、性别及BMI方面均匹配。采用ELISA法检测各组患者血浆中VEGF和ES的表达水平,并收集整理所有研究对象的临床资料和实验室数据。3.统计方法：Spearman相关分析进行相关性检验,余同第一章。[结果]1.微量蛋白尿组和大量蛋白尿组的血浆VEGF水平分别为50.93（26.99-72.24）pg/ml、63.89（42.84-93.38）pg/ml,均高于正常蛋白尿组[45.96（24.94-64.37）pg/ml]（P<0.05,P<0.01）；大量蛋白尿组VEGF水平高于微量蛋白尿组（P<0.05）。2.微量蛋白尿组和大量蛋白尿组的血浆ES水平分别为95.64（79.65-125.63）pg/ml、170.13（105.52-195.25）pg/ml,均高于正常蛋白尿组[86.67（76.69-119.02）pg/ml]（P<0.05,P<0.01）；大量蛋白尿组的血浆ES水平高于微量蛋白尿组（P<0.01）。3.所有研究对象的血浆VEGF与SBP （r=0.226,P<0.05）、糖尿病视网膜病变严重程度（r=0.221,P<0.05）、mAlb （r=0.226,P<0.01）、HDL（r=0.227,P<0.05）呈显著正相关,与eGFR （r=-0.237,P<0.05）及Alb （r=-0.233,P<0.05）呈显著负相关。4.所有研究对象的血浆ES与糖尿病病程（r=0.252,P<0.05）、糖尿病视网膜病变严重程度（r=0.229,P<0.05）、SBP（r=0.312,P<0.01）、BUN（r=0.459,P<0.01）、 sCr （r=0.585,P<0.01）、UA （r=0.320,P<0.01）及mAlb （r=0.491,P<0.01）呈显著正相关,与eGFR （r=-0.620,P<0.01）及Alb （r=-0.432,P<0.01）呈显著负相关。5.正常蛋白尿组和微量蛋白尿组血浆VEGF水平均与ES呈显著正相关（r1=0.633, P1<0.01; r2=0.532, P2<0.05）,而大量蛋白尿组血浆VEGF与ES不相关（r3=0.175,P3>0.05）。[结论]1.VEGF和ES在2型糖尿病肾病患者血浆中的表达量随着肾病进展逐渐增多,均与mAlb、eGFR存在显著的相关性,两者的联合检测可望成为评估DN严重程度的一种新的辅助手段。2.血浆VEGF和ES在2型糖尿病肾病不同临床分期中的相互关系发生变化,推测两者的表达失衡可能促进了DN的发生发展。