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一、研究背景众所周知,诸如吗啡、哌替啶、芬太尼等阿片类镇痛药具有强大镇痛作用,在临床上形成一类用于中、重度疼痛治疗的不可替代的药物,但是因其具有强大的致耐受、躯体依赖、成瘾、便秘以及呼吸抑制等不良反应潜能,大大限制了其在临床上的应用。近一个世纪以来,人们一直致力于寻找强效、无或低成瘾性强效镇痛药,然而,令人遗憾的是这个问题一直没有得到彻底解决。丁丙喏啡是半合成μ阿片受体（μ-opioid receptor,MOR）激动剂和κ阿片受体（κ-opioid receptor）阻断剂。近年来研究发现丁丙喏啡对痛敏素受体,又称痛敏素阿片肽受体（nociceptin opioid-peptide receptor,NOPR）,亦具有一定激动作用。与临床常用的镇痛药吗啡相比,虽然丁丙喏啡镇痛效价强于吗啡,但在热板实验中其镇痛效能仅为吗啡的30%,在热辐射甩尾实验中,仅为吗啡的70%;其镇痛有效作用时间比吗啡长,成瘾潜能、呼吸抑制、致便秘作用和致躯体依赖潜能均低于吗啡。目前丁丙喏啡在临床上主要用于镇痛、阿片类药物成瘾脱毒和防复吸。如上所述,尽管丁丙喏啡的不良反应低于阿片受体完全激动剂,但仍具较强成瘾潜能,在我国仍被列为一类精神药品管理。人们认为丁丙喏啡的成瘾性可能与其MOR部分激动和对NOPR激动相关。药理学研究发现NOPR激动剂在啮齿类动物以及非人灵长类动物疼痛模型上均表现出镇痛作用,且没有成瘾潜能,可能对阿片成瘾、躯体依赖具有一定抑制作用。因此,人们提出NOPR/MOR双重激动剂的概念,以期获得强镇痛、低成瘾的新型强效镇痛药。本研究所药物化学研究室以丁丙喏啡为先导化合物,成功获得了结构全新的NOPR/MOR双重激动剂BU08028（（2S）-2-[（5R,6R,7R,14S）-N-cyclopropylmethyl-4,5-epoxy-6,14-ethano-3-hydroxy-6-methoxymorphinan-7-yl]-3,3-dimethylpentan-2-ol）)（原代号ADP2）。已有的研究显示,该化合物对啮齿类和非人灵长类动物急性痛和神经痛均显示出良好的镇痛活性,不仅镇痛作用强,而且有效镇痛作用时间长;虽然在非人灵长类动物猴自身给药模型上未发现正性强化作用,但是在大鼠条件性位置偏爱模型中显示了一定的奖赏作用,且引发高活动性,提示该化合物可能依然存在一定成瘾潜能。近年研究发现,丁丙喏啡在体内可形成高浓度、长期存在的去烷基化代谢产物。该代谢产物的成瘾潜能和呼吸抑制等不良反应均显著高于原型。BU08028是由丁丙喏啡改构获得的,所以在理论上推测两者很可能有相似的代谢途径。近年来,氘代修饰技术被广泛应用于在不改变目标化合物药效学特点,同时可增加其代谢稳定性。本课题组合作研究者仲伯华教授正是利用此技术,成功合成了氘代BU08028（d2-BU08028）。他们在人肝微粒体酶离体温浴实验中发现,与BU08028相比,d2-BU08028的t1/2延长了39%,代谢速率减慢了63%;在大鼠肝微粒体酶温浴实验中得到了与人类似的实验结果;在大鼠口服（p.o）给药药代动力学研究发现,d2-BU08028原型的AUC、t1/2和Cmax分别是BU08028的1.3倍、1.5倍和1.3倍;d2-BU08028的去烷基化代谢产物的AUC和Cmax分别是BU08028的0.43倍和0.62倍。二、研究内容与目的鉴于以上研究背景,本学位论文拟以吗啡为对照,阐明BU08028和d2-BU08028镇痛、镇痛耐受及躯体依赖的作用特点,并借助药理学研究技术分析其可能受体作用机制;以BU08028为对照,通过对比分析BU08028和d2-BU08028实验结果,明确d2-BU08028可能的优势,为获得强镇痛、低成瘾的新型强效镇痛药提供实验基础。三、研究方法1.采用转棒实验研究BU08028以及d2-BU08028对小鼠运动协调性的影响;2.采用热板实验研究BU08028以及d2-BU08028的镇痛作用,包括时效和量效,以及镇痛耐受;同时采用拮抗剂预先阻断相应受体,观察各阿片受体的亚型功能对BU08028以及d2-BU08028镇痛的影响;3.采用热辐射甩尾实验研究BU08028以及d2-BU08028的镇痛作用,包括时效和量效,以及镇痛耐受;4.采用坐骨神经分支损伤（spared nerve injury,SNI）致神经痛实验研究BU08028以及d2-BU08028的镇痛作用,包括时效和量效,以及镇痛耐受;同时采用拮抗剂预先阻断相应受体,观察各阿片受体的亚型功能对BU08028以及d2-BU08028镇痛的影响;5.采用纳洛酮催促戒断实验研究BU08028以及d2-BU08028的躯体依赖;6.采用工具药NOPR激动剂以及拮抗剂研究NOPR对吗啡镇痛、耐受以及躯体依赖的作用。四、研究结果（一）运动协调性以雄性8周龄ICR小鼠为实验动物,以转棒实验为模型,以溶剂作对照,采取皮下（s.c）给药方式,开展BU08028和d2-BU08028对运动协调性影响的研究。研究结果发现,与溶剂对照组相比,s.c给予0.06 mg/kg、0.2 mg/kg以及0.6 mg/kg三个剂量,BU08028和d2-BU08028在给药后2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h均不能显著影响小鼠运动协调性（P＞0.05,具有一个重复测量的双因素方差分析,Tukey检验,n=12）。提示在上述剂量范围内BU08028和d2-BU08028对动物的行为协调性没有显著影响,在上述剂量范围内不会影响下述实验的结果判定。（二）镇痛作用1.小鼠热板实验以雌性8周龄C57/BL6小鼠为实验动物,以55 oC热板法为实验模型,以吗啡作对照,分别采取s.c和p.o两种给药方式,开展BU08028和d2-BU08028的镇痛作用研究。研究结果发现BU08028和d2-BU08028均表现出强大（效能与吗啡相同,效价明显强于吗啡）、剂量依赖性、100%镇痛作用,有效镇痛时间达8 h以上,显著长于吗啡（2 h）。分别s.c给予BU08028和d2-BU08028的镇痛ED50值为0.21 mg/kg和0.17 mg/kg,两者的镇痛效价没有显著性差异;分别p.o给予BU08028与d2-BU08028的镇痛ED50值为2.5 mg/kg和1.9 mg/kg;p.o给予d2-BU08028的镇痛效价强于BU08028（t’=4.05,T=3.18,t’＞T,*P＜0.05,独立两样本t检验,n=12）。2.小鼠热辐射甩尾实验以雄性8周龄ICR小鼠为实验动物,以热辐射甩尾法为实验模型,以吗啡作对照,采取s.c和p.o两种给药方式,开展BU08028和d2-BU08028的镇痛作用研究。研究结果发现,吗啡在0.5 h达到完全镇痛作用,有效作用时间可持续到2 h;BU08028和d2-BU08028均表现出强大（镇痛作用效能与吗啡相同,效价明显强于吗啡）、剂量依赖性、100%镇痛作用,有效镇痛时间达8 h以上,显著长于吗啡（2 h）。分别s.c给予BU08028与d2-BU08028的镇痛ED50值分别为0.017 mg/kg和0.017 mg/kg,两者的镇痛效价没有显著性差异。分别p.o给予BU08028与d2-BU08028的镇痛ED50值为0.29 mg/kg和0.19mg/kg;p.o给予d2-BU08028的镇痛效价强于BU08028（t’=5.57,T=3.18,t’＞T,*P＜0.05,独立两样本t检验,n=12）。3.小鼠慢性神经痛实验以雄性8周龄ICR小鼠为实验动物,以坐骨神经结扎所致神经痛为实验模型,以吗啡为对照,开展BU08028和d2-BU08028的镇痛作用研究。研究结果发现,BU08028和d2-BU08028（s.c和p.o）对慢性神经性疼痛具有强大的镇痛作用。在镇痛时效方面,分别s.c给予BU08028（0.06 mg/kg）和d2-BU08028（0.06 mg/kg）,在给药后4 h可达到完全镇痛,作用时间比吗啡长（2 h）,可持续到用药后8 h;p.o分别给予BU08028（0.86 mg/kg）和d2-BU08028（0.6 mg/kg）在4 h可达到完全镇痛,有效镇痛作用时间可持续到12 h,明显长于吗啡（2 h）。在镇痛量效关系方面,s.c分别给予BU08028和d2-BU08028的镇痛ED50值为0.033 mg/kg和0.029 mg/kg。与吗啡相比,BU08028与d2-BU08028两者的镇痛效价均显著强于吗啡(t Morphine’=164.70,TBU08028=3.18,t Morphine’=122.70,Td2-BU08028=3.18,t’＞T,*P＜0.05,独立两样本t检验,n=12);与BU08028相比,d2-BU08028的镇痛效价显著强于BU08028（t’=3.33,T=3.18,t’＞T,*P＜0.05,n=12）;p.o给予BU08028和d2-BU08028的镇痛ED50值分别为0.33 mg/kg、0.27 mg/kg,与BU08028相比,d2-BU08028的镇痛效价有显著性差异（t’=3.41,T=3.18,t’＞T,*P＜0.05,独立两样本t检验,n=12）。（三）受体作用机制研究1.小鼠热板急性痛实验以雌性8周龄C57/BL6小鼠为实验动物,以热板法为实验模型,采用MOP阿片受体拮抗剂纳洛酮、纳曲酮（s.c）以及NOPR拮抗剂SB612111（s.c）、J-113397（i.p）作为工具药,采取s.c给药方式,开展BU08028和d2-BU08028在小鼠热板镇痛受体作用机制研究。研究结果发现,纳洛酮（1 mg/kg,s.c）、纳曲酮（0.3 mg/kg,s.c）能够完全阻断BU08028和d2-BU08028的镇痛作用;SB612111（10 mg/kg,s.c）和J-113397（3 mg/kg和12 mg/kg,i.p）则能够增强BU08028和d2-BU08028的镇痛作用(***P＜0.001,与BU08028相比;###P＜0.001,与d2-BU08028相比;具有一个重复测量的双因素方差分析,Tukey检验,n=12)。上述实验结果提示,在小鼠热板实验中,BU08028和d2-BU08028的镇痛作用主要是由MOR介导的。2.小鼠慢性神经痛实验以雄性8周龄ICR小鼠为实验动物,以坐骨神经结扎所致神经痛为实验模型,采用MOR拮抗剂纳曲酮（s.c）和NOPR拮抗剂J-113397（i.p）作为工具药,采取s.c给药方式,开展BU08028和d2-BU08028在小鼠神经痛镇痛的受体作用机制研究。研究结果发现,纳曲酮（1 mg/kg,s.c）以及J-113397（6 mg/kg,i.p）均能够部分阻断BU08028和d2-BU08028的镇痛作用(***P＜0.001,与BU08028相比;###P＜0.001,与d2-BU08028相比;具有一个重复测量的双因素方差分析,Tukey检验,n=12)。上述实验结果提示,在小鼠坐骨神经结扎所致神经痛实验中,BU08028和d2-BU08028的镇痛作用主要是由MOR和NOPR共同介导的。（四）镇痛耐受实验1.小鼠热板实验以雌性8周龄C57/BL6小鼠为实验动物,以热板法为实验模型,以吗啡作对照,采取s.c连续给药方式,吗啡每天给药2次,BU08028和d2-BU08028每天给药1次,开展BU08028和d2-BU08028的镇痛耐受研究。上述三药给药剂量为100%镇痛剂量。研究结果发现,与吗啡相比,d2-BU08028在给药后第3天和第4天的镇痛耐受程度低于吗啡（*P＜0.05,与吗啡比较,具有一个重复测量的双因素方差分析,Tukey检验,n=12）;与BU08028相比,d2-BU08028所致耐受有减弱的趋势,但无显著差异。2.小鼠热辐射甩尾实验以雄性8周龄ICR小鼠为实验动物,以热辐射甩尾法为实验模型,以吗啡作对照,采取s.c连续给药方式,上述三药给药剂量为100%镇痛剂量,开展BU08028和d2-BU08028的镇痛耐受研究。研究结果发现,与吗啡比较,s.c给予镇痛剂量d2-BU08028在给药后诱发的镇痛耐受显著弱于吗啡（*P＜0.05,与吗啡比较,具有一个重复测量的双因素方差分析,Tukey检验,n=12）;与BU08028相比,d2-BU08028所致耐受有减弱的趋势,但无显著差异。3.小鼠慢性神经痛镇痛耐受实验以雄性8周龄ICR小鼠为实验动物,以坐骨神经结扎神经痛为实验模型,以吗啡为对照,开展BU08028和d2-BU08028的镇痛耐受研究。研究结果发现,与每组的第1天相比,在第9天s.c给予镇痛剂量吗啡（10 mg/kg）、BU08028（0.06mg/kg）、d2-BU08028（0.06 mg/kg）在慢性神经性疼痛中均形成了镇痛耐受,与吗啡比较,s.c给予镇痛剂量BU08028、d2-BU08028在慢性神经性疼痛中镇痛耐受形成的程度和速度均显著弱于吗啡（*P＜0.05,***P＜0.001,与吗啡比较,与具有一个重复测量的双因素方差分析,Tukey检验,n=12）。与BU08028相比,d2-BU08028所致耐受减弱且有显著性差异(#P＜0.05,##P＜0.001,###P＜0.001,与具有一个重复测量的双因素方差分析,Tukey检验,n=12)。（五）躯体依赖实验以雄性8周龄ICR小鼠为实验动物,采用药物递增剂量方案,以纳洛酮催促戒断法为实验模型,以吗啡作对照,采取s.c给药方式,开展BU08028和d2-BU08028的躯体依赖研究。研究结果发现,s.c给予递增剂量的吗啡（10-50 mg/kg,每天给2次）小鼠在纳洛酮催促下出现明显戒断反应,提示形成了躯体依赖（***P＜0.001,与对照溶剂组比较,Kruskal-Wallis检验,n=12）;s.c给予递增剂量BU08028和d2-BU08028（剂量方案1:0.06-0.3 mg/kg;剂量方案2:0.5-2.5 mg/kg,每天1次）均没有表现出纳洛酮催促戒断反应,提示未形成躯体依赖(***P＜0.001,**P＜0.01,与对照溶剂组比较;###P＜0.001,##P＜0.01,与吗啡比较,Kruskal-Wallis检验,n=12)。以上结果表明,BU08028和d2-BU08028均未形成躯体依赖,但二者无显著差异。（六）激动或拮抗NOPR对MOR介导的镇痛、耐受以及躯体依赖的作用研究以雌性8周龄C57/BL6小鼠为实验动物,以热板法为实验模型,采用NOPR激动剂SCH221510（3 mg/kg和10 mg/kg）以及NOPR拮抗剂SB612111（10 mg/kg）作为工具药,采取s.c给药方式,开展激动或拮抗NOPR对MOR介导的镇痛、耐受以及躯体依赖的作用研究。在镇痛作用方面,NOPR拮抗剂SB612111（10 mg/kg,s.c）在给药后0.5 h和1 h有增强吗啡镇痛作用的趋势,但无显著性差异;NOPR激动剂SCH221510（3 mg/kg s.c）在给药后0.5 h则降低了吗啡的镇痛作用（*P＜0.05,具有一个重复测量的双因素方差分析,Tukey检验,n=10）;在镇痛耐受方面,与每组的第1天相比,第7天给予NOPR拮抗剂SB612111+吗啡以及NOPR激动剂SCH221510+吗啡均形成了镇痛耐受（***P＜0.001,Kruskal-Wallis检验,n=10）;与吗啡相比,NOPR阻断剂SB612111可减轻吗啡的镇痛耐受,NOPR激动剂SCH221510则促进了吗啡镇痛耐受的形成(##P＜0.01,具有一个重复测量的双因素方差分析,Tukey检验,n=10);在躯体依赖方面,与溶剂对照组相比,吗啡单药、SCH221510+吗啡、SB612111+吗啡均形成明显的躯体依赖（**P＜0.01,***P＜0.001,Kruskal-Wallis,n=10）,而与吗啡比较,NOPR激动剂SCH221510+吗啡有降低吗啡躯体依赖的趋势,而NOPR阻断剂SB612111+吗啡则有促进吗啡躯体依赖的趋势,但无显著性差异。五、结论1、在本学位论文实验条件下,与吗啡比较,BU08028和d2-BU08028镇痛效价显著强于吗啡,有效镇痛时间长于吗啡,镇痛效能与吗啡相同;2、与吗啡比较,BU08028和d2-BU08028致镇痛耐受作用比吗啡弱,未发现具有致躯体依赖作用;3、BU08028和d2-BU08028在急性痛中发挥镇痛作用主要与激动MOR有关,在慢性痛中发挥镇痛作用主要与激动MOR和NOPR两种受体有关。4、d2-BU08028镇痛作用（效价）强于BU08028,致耐受作用弱于BU08028,均未发现有致躯体依赖作用;鉴于d2-BU08028镇痛作用更强,致疼痛耐受潜能更小,未发现有致躯体依赖潜能,有自主知识产权（BU08028无专利保护）,值得进一步研究。