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目的 通过检测蕈样肉芽肿(granuloma fungoides，曾称蕈样霉菌病，mycosis fungoides，MF)皮损及外周血中人类疱疹病毒1型(又称单纯疱疹病毒-1，herpes simplex virus 1，HSV-1)、2型(单纯疱疹病毒-2，HSV-2)、4型(EB病毒，EBV)、5型(人类巨细胞病毒，human cytomegalovirus，HCMV)及8型(human herpesvirus 8，HHV-8)的特异性DNA序列，探讨MF与这五型人类疱疹病毒之间的相关性。 材料与方法 一、实验材料 (一)研究材料 1、病例资料 32份皮损及15份外周血标本取自33例经临床和病理确诊的蕈样肉芽肿患者，均来自中国医科大学第一医院皮肤科。 2、对照资料 (1)其它皮肤病患者：慢性湿疹患者皮损13份、外周血6份，慢性单纯苔藓患者皮损11份、外周血5份； (2)正常对照：正常皮肤29份及健康献血员外周血40份； p）阳性对照：HSV－1感染的细胞中提取的 DNA作为 HSV－1的阳性对照；EBV和HHV－8共感染的细胞系（BC－1）中提取的DNA作为EB病毒及HHV－8 DNA的阳性对照。 （二）引物 1．内对照引物：扩增人类p－球蛋白基因的特异性引物PC03／PC04，PC03序列：5’一 ACA CAA CTG TGT TCA CTA GC－3’，PCM序列：5’－CAA Cn CAT CCA C盯 TCA CC－3二产物长度 110hp。 人扩增HSV－1、HSV－2JBV和HCMV的通用引物，上游引物（P－l）序列：5’－CGA CTT TGC CAG CCT GTA CC－3二下游引物（P－2）序列：5’－AGT CCG TGT CCC CGT AGA TG－3’。HSV叫、HSV－2上BVJCMV经该引物扩增后，产物片段长度分别为518hp、518hp、524hp和589hp。 3、扩增 HHV－8 KS330Bam片段的特异性引物，KSI序歹：5’－AGC CGA AAG GAT TCC ACC AT－3二人 序列：5’－TCC GTG’ITG TCT ACG TCC AG－3’，产物长度233hP。二、实验方法 l、DNA的提取 采用酚－氯仿法提取皮损及外周血白细胞中基因组 DNA，以紫外分光光度计测定浓度及纯度后，－20℃保存待用。 2、PCR技术 所提取的DNA均以引物PC03／PC04扩增人p－球蛋白，产物片段长度 110hP，阳性标本人选本实验。以 HSV－l、HSV－2、EBV、HCMV的通用引物P－l／P－2，采用聚合酶链反应（o灯me。ase chain reaction，PCR）技术检测上述病毒DNA序列。PCR反应后，通过对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可直接将HCMy分辨开来。以针对HHV－8 DNA KS330Bam片段的特异性引物KSI／KSZ检测 HHV－8，产物长度为 233 hP。 ·2· 3、限制性核酸内切酶酶切鉴定 琼脂糖凝胶电泳后，以DNA片段回收试剂盒回收通用引物P－l／P－2扩增的阳性产物O 左右入以限制性内切酶BalnHI和Sma作酶切分析，区分HSV－l、HSV－2及 EBV。以特异性限制性核酸内切酶PSt互对KSI／KSZ．扩增产物K）作酶切反应，酶切产物以12％聚丙烯酚胺凝胶电泳鉴定。 结 果一、HSV—1、HSV—2、EBV、HCMV检测结果： （一严CR结果 1．阳性对照：以通用引物P－l／P一二扩增HSV—1感染细胞中提取的DNA和BC－1细胞DNA后，均出现长度约520hP 的片段； 2、荤样肉芽肿患者：32份皮损中有7份J5份外周血中有2份均扩增出长度约520hp的产物； 3、其它皮肤病：24份皮损＊ 份外周血以通用引物扩增后均末见阳性条带； 4、正常对照：29份正常皮肤／0份健康献血员外周血中均阴性。 （二）PCR产物的 BamH和 Sma ］：酶切分析结果： 2份章样肉芽肿皮损及2份外周血中检出的520hP左右的产物回收后，均被 Sma切成476hp和412hp，但不能被 BamH切断，与预期结果及mV八阳性对照一致，证实为田V－IDNA来源；另外5份章样肉芽肿皮损中检出的520hP左右的产物回收后，MIJ被 BamH和 Sma切成 247hP ＊77hP和 100hP、424hP两段，与预期结果及EBV阳性对照一致，证实为EBV DNA来源。HSV－1在阜样肉芽肿皮损与外周血中无同时阳性者，并且所有标本 ·3·无HSV－l与EB病毒同时阳性者。PCR扩增及酶切结果显示，所有蜜样肉芽肿皮损及外周血中均未检出HSV－2及HCMVDNA。正常对照及慢性湿疹、慢性单纯苔薛标本中均未检出此四型人类疤疹病毒DNA。 经X‘检验荤样肉芽肿皮损及外周血中HSV刁检出率与正常皮肤（P＝0．493入献血员外周血（P二 0．194）以及慢性湿疹。慢性单纯苔鲜患者的皮损（P＝0．50X外周血（P二 0．492）比较，差异均无显著性。章样肉芽肿皮损及外周血中EBV检出率与正常皮肤（P＝0．054人慢性湿疹及慢性单纯苔蔡患者的皮损汐＝0．064）比较／值均大于0．05，差异也无显著性。二、HHV－8检测结果 （一严CR结果 且、阳性对照：BC－二DNA经引物对Ka／K驭可扩增出233…产物，此产物被限制性内切酶pstl酶切成138hp和95hp两段； 2、章样肉芽肿患者：32份皮损中有8份及15份外周