从猪肠黏膜中提取的肝素是一种广泛使用的临床抗凝血药物。然而,动物来源的肝素钠污染事件引起了人们对于动物源肝素的安全性和可靠性的广泛关注。化学酶法合成肝素是以肝素前体多糖（heparosan）为起始碳骨架,在N-脱乙酰基/N-磺基转移酶,C5-异构化酶,2-O-磺基转移酶,6-O-磺基转移酶,3-O-磺基转移酶的催化下合成工程化肝素,该方法为肝素的生产提供了一条安全的替代途径。目前,肝素前体多糖主要是从病原菌大肠杆菌K5菌株中提取,该菌是引起尿路感染的主要菌株之一。大肠杆菌Nissle 1917（EcN）是一种革兰氏阴性益生菌,通过增强肠道黏膜屏障,与病原体竞争肠道内营养物质,调节机体免疫因子的分泌,从而刺激宿主产生免疫反应。EcN作为没有任何已知毒素的益生菌,是制备肝素前体多糖的安全来源。然而,肝素前体多糖和磺基转移酶是需要分开制备的,显著增加了工作量和经济成本。在本研究中,大肠杆菌EcN经过工程改造,携带了编码T7 RNA聚合酶的BL21（DE3）菌株λDE3区;并通过λ-Red同源重组原理,将基因gor,trx B敲除,以促进含有二硫键的蛋白质的折叠,从而构建了EcN::T7M菌株。该工程菌株EcN::T7M能够在细胞内表达磺基转移酶,并同时将肝素前体多糖分泌到培养基中。EcN::T7M能够分别表达人N-脱乙酰基/N-磺基转移酶-1（NDST-1）的磺基转移酶结构域（NST）和小鼠3-O-磺基转移酶-1（3-OST-1）。通过分批补料发酵,EcN::T7M菌株表达的NST产量达到了0.21 g/L,肝素前体多糖的产量达到了0.85 g/L。经过~1H核磁共振（NMR）分析显示,该肝素前体多糖保留了完整的功能结构单元。经过纯化后,以3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸盐（PAPS）作为磺基供体,通过NST催化作用对纯化后的肝素前体多糖进行了硫酸化修饰。元素组成的分析表明,修饰后的肝素前体多糖分子中有80%以上的二糖重复单元被N-硫酸化,达到了与肝素分子相似的N-硫酸化修饰水平。综上所述,本研究构建的双功能菌株EcN::T7M能够用于同时制备磺基转移酶和肝素前体多糖,并且实现了酶促肝素前体多糖的硫酸化修饰。此外,EcN::T7M菌株是由tac启动子和T7启动子驱动的外源蛋白表达宿主,也可以用于表达其他酶或蛋白质。