论文部分内容阅读
Argonaute (AGO)蛋白是 RNA 诱导沉默复合物(RISC,RNA-indeced silencing complex)的核心元件,能够与小RNA结合,对靶基因进行剪切或抑制其表达。小分子RNA是生命活动重要的调控因子,在基因转录和转录后加工,个体发育,遗传和表观遗传等生命活动中发挥重要的作用。近来研究发现,转座子(TE,Transposableelement)可以产生小RNA发挥作用,而家蚕中近一半的基因组序列为转座子基因。课题前期研究我们通过RIP-seq法鉴定和分析了家蚕BmN细胞中BmAG02蛋白结合的RNA,发现BmAG02结合RNA中存在大量TEs及TEs来源的小RNA (TE-siRNA),其中BmAG02结合TEs中,Bm1645的丰度远远大于其它结合的TEs,而Bm1645来源的TE-siRNA丰度也远远大于其它TEs来源的小RNA,表明Bm1645转座子是TE-siRNA的“生产基地”。在前期研究基础上,本课题进一步通过RIP-seq方法鉴定了家蚕五龄幼虫中BmAG02蛋白的结合TE-siRNA和TEs,同时研究了转座子Bm1645来源TE-siRNA与BmAG02蛋白的结合及其对Bm1645表达调控的关系。首先利用前期获得的高效价BmAG02蛋白单克隆抗体,通过免疫共沉淀法获得家蚕五龄幼虫内源性BmAG02蛋白复合物,并成功分离其结合RNA,将50nt以下小RNA与200nt以上长链RNA分别进行高通量测序及生物信息学分析,鉴定BmAG02结合的TEs和TE-siRNA。结果表明,家蚕五龄幼虫BmAG02结合RNA中同样含有大量TEs和TE-siRNA,其中转座子Bm1645丰度(RPKM= 73982.57)远远大于其他转座子丰度,同时Bm1645来源TE-siRNA丰度(1814707)也远远大于其他转座子来源TE-siRNA丰度,与前期BmN细胞实验结果相符。上述结果进一步证明,家蚕BmAG02蛋白可结合大量TE-siRNA和TEs,尤其是Bm1645转座子及其来源的TE-siRNA,推测Bm1645来源TE-siRNA可能结合BmAG02介导Bm1645的表达。我们进一步选取来源于Bm1645的6条TE-siRNAs,通过凝胶阻滞实验验证TE-siRNA能否与BmAG02蛋白结合。结果表明,有4条TE-siRNAs可以和BmAG02蛋白结合产生凝胶阻滞条带,分别为 TE-siRNA134、TE-siRNA610、TE-siRNA671 和 TE-siRNA688,表明这 4个TE-siRNAs可能结合BmAG02蛋白行使功能。推测Bm1645来源的TE-siRNA能够与具有活性的BmAG02蛋白结合,从而影响Bm1645的表达。进一步采用双荧光素酶实验验证了 4个TE-siRNAs在Bm1645上的识别位点。选取四个TE-siRNAs在Bm1645基因上对应的靶位点序列及其突变序列,分别克隆到pIEx-1-Rluc-Luc载体(本实验室构建的双荧光素酶载体)。将重组后的载体与合成的TE-siRNA共转染家蚕BmN细胞,采用双荧光素酶报告法检测。结果显示,与突变对照相比,转染正常靶位点序列载体和TE-siRNA后,报告基因萤火虫荧光素酶催化底物的发光值显著降低(p<0.05)。说明TE-siRNA134、TE-siRNA610、TE-siRNA671和TE-siRNA688能够结合Bm1645的靶位点并抑制基因表达。最后我们验证了 TE-siRNA对Bm1645转座子的表达调控作用。将合成的TE-siRNA134、TE-siRNA610、TE-siRNA671 和 TE-siRNA688 mimics 分别转染家蚕 BmN 细胞,荧光定量 PCR法检测Bm1645的转录水平。结果显示,与阴性对照相比,转染TE-siRNAmimics后Bm1645在BmN细胞中的转录水平均出现了显著的下调(p<0.05),进一步证实TE-siRNA能够与BmAG02蛋白相互作用,并调控TEs的转录水平。本课题首次鉴定了家蚕转座子来源TE-siRNA可以结合BmAG02蛋白并在其介导下调控转座子的表达,为家蚕乃至昆虫中新型小RNA的鉴定与功能研究打下基础。