结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一,在我国的发病率呈逐年上升的趋势。近些年来,虽然随着诊疗新技术的应用和化疗药物的不断更新,结直肠癌患者的预后得到了极大地改善,但是患者总的生存率并没有得到显著提高,主要原因是多数结直肠癌患者在行根治性手术前已出现了微转移。因此,阐明结直肠癌发生及转移的分子机制,是提高结直肠癌患者生存率和治愈率的关键问题,也是当前肿瘤研究的热点问题。　　 肿瘤的转移是一个多步骤、多基因参与的复杂过程。许多基因参与肿瘤转移的过程,但其具体调控机制还有待进一步深入研究。近年来随着人类基因组计划的完成,以及蛋白质组学和转录组学技术的蓬勃开展,促使RNA组学研究日趋成熟,这些新技术为揭示肿瘤转移机制带来了新的希望。目前中的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在生命过程中所发挥的不可忽视的重要作用已经逐步得到广泛的重视和认可。通常,基因组研究集中在对基因组序列中开放读码框的注释和功能划定,然而在真核细胞中,仅有一小部分组分是基因组编码蛋白质的氨基酸序列信息,未知功能的非编码序列占人类基因组的98％,它们在调节基因表达中起着极为重要的作用。ncRNA被认为,在所有真核细胞调节中起着关键作用,可能参与转录调控、DNA复制、染色体配对和染色体凝集等过程。目前最新的研究成果显示,有一大类功能性RNA分子或隐藏在蛋白质编码区之间或位于编码蛋白质区内,其功能有待进一步阐明。　　 我们在结直肠癌特异性转移相关基因的分析研究中,通过对来源同一亲本具有不同转移潜能的结直肠癌细胞系进行表达谱芯片分析,发现在上调表达的298个基因中,其中一个基因就是MALAT-1(metastasis associated lungadenocarcinoma transcriptl,MALAT-1),它是一个非编码RNA,属于长非编码RNA类(>200nt)(long non-coding RNA,IncRNA),定位于人染色体11q13.1,全长8707nt,缺乏明确的开放式阅读框,不编码蛋白质。MALAT—1在不同转移能力的结直肠癌细胞系中差异表达,我们推测MALAT-1可能具有对结直肠癌转移相关基因的调控作用,与结直肠癌的转移密切相关。本课题组前期采用原位杂交和Real-time PCR的方法检测了结直肠癌组织、肿瘤转移组织和正常组织,以及9种人结直肠癌细胞株的MALAT-1表达情况,分析后发现MALAT-1在结直肠癌中的表达与肿瘤的转移密切相关。同时本课题组在前期的实验研究中运用生物信息学计算方法和蛋白质组学技术,筛查到了一个可能是MALAT-1调控的靶标基因,为进一步分析和鉴定长非编码RNA MALAT-1基因调控结直肠癌转移的相关靶基因奠定了坚实的基础。　　 为了进一步研究和论证长非编码RNA MALAT-1基因调控结直肠癌转移的机制和所调控的靶基因的功能,本研究分别从两个不同层面,全面分析MALAT-1结构和功能。首先采用了慢病毒稳定转染的方法,利用RNA沉默技术(RNA interference,RNAi)和RNA激活技术(RNA activation,RNAa)研究MALAT-1基因对结直肠癌细胞株SW480增殖、侵袭及转移的作用,从而探讨MALAT-1基因的表达对结直肠癌细胞株SW480生物学特性的影响；其次从MALAT-1基因的结构层面,通过拆分MALAT-1基因的全长来寻找其突变区域和核心功能区；最后,利用本课题组前期采用的生物信息学计算方法,结合本次研究采用的mRNA基因芯片技术,筛查到了一系列MALAT-1不同表达水平的结直肠癌细胞株SW480的差异表达的基因,再结合本课题组前期利用蛋白质组学筛查到的一系列差异表达蛋白,综合确定出长非编码RNA MALAT-1基因调控结直肠癌转移的靶标基因,为后续研究结直肠癌转移相关基因MALAT-1所调控的靶基因的生物学功能和进一步深入研究结直肠癌发生发展的机理提供了重要依据和新的思路。　　 第一部分:MALAT-1基因全长的突变区域和核心功能区的研究　　 MALAT—1基因长达8707nt,给我们的研究带来了一定的困难。为了更好的研究结直肠癌转移的分子机制,寻找MALAT-1的突变区域和核心功能区。我们运用降落PCR技术和测序技术分别检测了不同转移潜能的结直肠癌细胞株SW620和SW480及结直肠癌原发癌组织和正常组织MALAT-1基因的突变情况。设计可分段扩增MALAT-1的5对引物,提取总RNA和RT-Touchdown PCR分5段扩增出MALAT-1全序列。通过分段测序技术鉴定分析,综合确定出MALAT-1的突变位点集中于MALAT-1的中后部(5434nt-8441 nt)。　　 其后研究了MALAT-1基因5个片段(MALAT-1/fragments)过表达后对结直肠癌细胞株SW480生物学行为的影响,逐段分析MALAT-15个片段(MALAT-1/fragments)的表达与结直肠癌细胞转移相关生物学行为变化的相关性。研究结果显示结直肠癌细胞株SW480的生长、增殖能力,以及体外侵袭转移能力与MALAT-1的5个片段(MALAT-1/fragments)的表达水平密切相关。当MALAT-1的5个片段(MALAT-1/fragments)的表达水平升高时,细胞的活力大大提升,增殖速度也明显加快；更有趣的是,在实验研究中发现MALAT-1基因中的6918nt-8441nt(MALAT-1/6918nt-8441nt)的过表达使得细胞的增殖和侵袭潜能均显著增强,说明MALAT-1基因中的6918nt-8441nt这部分区域与结直肠肿瘤细胞的转移存在着明显的正相关关系,因此我们推测MALAT-1基因中的6918nt-8441 nt片段是MALAT-1基因的核心功能区。长非编码MALAT-1基因核心功能区的发现为后续MALAT-1基因的功能研究提供了极大地便利。　　 第二部分:长非编码MALAT-1基因在结直肠癌发展、转移中的作用　　 MALAT-1基因最初是在研究人非小细胞肺癌的转移中通过减除杂交法筛选鉴定出的一个新的长非编码RNA。它是定位于人类11q13染色体上长约8700nt的长非编码RNA,它缺乏有意义的开放性读码框,在体外无法翻译出相应的蛋白质。它在多种肿瘤组织和细胞中表达失调。因而,MALAT-1可能是一个潜在的广谱的人类肿瘤标志物。MALAT-1基因广泛表达于哺乳动物的正常组织中,在肿瘤组织中高表达,并且发现它与转移密切相关。　　 为进一步研究MALAT-1基因在结直肠癌转移中的作用,我们分别采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)和本课题组前期运用的RNA激活(RNA activation,RNAa)技术,采用慢病毒感染的方法,将特异性针对MALAT-1的RNAi病毒和特异性针对MALAT-1基因Promoter区域的RNAa病毒分别感染中等内源性表达MALAT-1的结直肠癌SW480细胞株,采用荧光定量PCR检测MALAT-1基因的表达情况,采用MTT、流式细胞术、平板克隆形成实验、Transwell侵袭小室等实验技术分析MALAT-1基因对结直肠癌SW480细胞生物学行为的影响。结果显示:MTT实验发现MALAT-1基因能够明显的加快细胞增殖的速度。流式细胞仪分析细胞周期提示MALAT-1基因可以通过促进细胞进入增殖期而提高细胞的体外增殖能力。平板克隆形成实验提示MALAT-1的表达能够显著提高细胞的克隆形成能力。细胞体外Transwell侵袭小室实验发现MALAT-1基因的表达上调能够显著增强细胞的侵袭运动潜能,进而促进肿瘤细胞发生转移。　　 第三部分:MALAT-1参与调控结直肠癌发展、转移的分子机制的初步探讨　　 结直肠癌发生与转移的分子基础是一个立体、整体水平上的蛋白质相互作用和编码基因与非编码基因相互调控的结果,其中人类基因组中数量巨大的非编码RNA基因可能对转移相关的功能基因具有调控作用。不同种类的非编码RNA基因具有不同的调节功能,它们共同参与肿瘤的转移过程。本研究以MALAT-1为研究对象,通过高通量人全基因组表达谱芯片(Gene Chips)技术筛选MALAT-1基因下游调控结直肠癌转移相关的靶基因及关键的信号通路；采用生物信息学分析技术高通量筛选MALAT-1基因潜在靶标基因,为深入研究结直肠癌的发展、转移机制提供新的思路,寻找治疗结直肠癌的靶点和能够预测结直肠癌转移及预后的分子标志物。　　 通过应用Roche公司制备的NimbleGen寡核苷酸表达谱芯片对稳定敲低MALAT-1的结直肠癌细胞亚系SW480/MALAT-1-RNAi、稳定激活MALAT-1表达的结直肠癌细胞亚系SW480/MALAT-1-RNAa及其阴性对照结直肠癌细胞株SW480/MALAT-1-NC,进行了全基因组表达谱芯片检测。每组均进行3次的生物学重复。应用芯片显著性分析(Significance Analysis of Microarray,SAM)软件分析,共筛选获得了243个共同差异表达的基因,其中包括93个上调基因及150个下调基因。系统聚类分析,成功地将三组检测样本中的243个共同的差异表达基因分为三类。为了进一步筛选这些共同的差异表达基因的功能,利用上海康城生物技术有限公司生物信息学综合分析平台对全基因组表达谱芯片筛选得到的可能受MALAT-1基因调控的一系列差异表达基因的生物学功能及参与的信号转导通路进行了初步分析,并对其进行文献挖掘,分析这些基因的生物学功能及研究价值；利用GOfact软件平台进行在线聚类分析,对筛选获得的243个共同的差异表达基因所参与的生物过程进行注释,发现它们分别涉及细胞通信、细胞连接、细胞周期、细胞增殖、蛋白修饰及细胞迁移等过程；对这243个差异表达的基因所参与构成的细胞组件进行注释,它们在细胞内定为于胞浆、细胞骨架、细胞核、细胞膜、细胞器及蛋白复合物等部位；对这243个差异表达的基因所介导的分子功能进行注释,它们分别发挥离子结合、核酸结合、蛋白结合、催化活性、酶调节活性、结构分子激活、转运蛋白活性等生物学作用。运用Passway在线软件分析平台,对获得的这243个差异表达的基因进行Passway分析发现这些基因与结直肠癌转移相关的MAPK、TGFβ、P53等信号通路密切相关。上述分析均表明,MALAT-1基因能够通过调控下游的靶标基因及其相关信号通路上的关键蛋白,改变肿瘤细胞的生物学行为,从而介导结直肠癌的发展和转移。　　 本课题组前期采用生物信息学预测分析的方法得到47个MALAT-1潜在靶标基因,筛选得到的基因中绝大部分蛋白都与肿瘤恶性转化和转移等行为相关,涉及肿瘤细胞生长、运动、粘附、凋亡等过程,研究结果为阐明结直肠癌发展、转移的机制及肿瘤早期诊断、寻找预测结直肠癌转移的潜在标志物提供了理论依据。结合本课题组前期的蛋白质组学分析结果和本次研究的全基因组表达谱芯片得到的差异表达基因结果,我们综合确定出AKAP-9基因是受MALAT-1调控的靶基因,为后续研究结直肠癌转移相关基因MALAT-1所调控靶基因的生物学功能和进一步阐明结直肠癌发展和转移的机理提供新的研究思路和重要的理论依据。