随着现代工业、交通运输业和建筑业的发展,脊髓损伤(spinal cord injury, SCI )的发生率也呈逐年上升的趋势。据报道,美国每年约有1万例新的脊髓损伤患者,我国上海脊髓损伤的年发生率约为13.7/100万。当今脊髓损伤在全球呈:高致残率(全瘫为67%)、高耗费(5-7万美元/患者/年,美国)、低死亡率(<5%)、患者主要为青壮年(70%患者<40岁)等特点,给社会带来巨大的损失和沉重的负担,已成为全球性的医疗难题。目前临床上对脊髓损伤的治疗主要着手于防治脊髓损伤后脊髓继发性损害、保护残存神经元功能,方法有早期大剂量甲基强的松龙冲击疗法、外科干预及康复训练等,而这些方法对轴突连续性中断导致的神经元靶源性营养供给减少和生理电信号及化学传递功能受损的作用微乎其微,因而预后仍然很差。这是由于脊髓损伤后脊髓神经元再生功能差,损伤区域与正常组织之间有星形胶质细胞增生形成胶质瘢痕作为物理屏障及受损神经元轴突缺少神经营养因子的刺激而无延长能力作为化学屏障等因素有关。因此,促进脊髓再生、克服再生屏障是目前国内外研究的重点及热点。本项目旨在探索利用组织工程技术进行自体雪旺氏细胞移植的方法治疗脊髓损伤,使脊髓损伤后神经纤维再生、传导功能恢复,为脊髓损伤的治疗作进一步基础及临床研究提供理论基础。近20年来国内外研究已证明,成年神经元具有再生的潜能,损伤的脊髓神经元在适宜的条件下可以再生。在促进轴突再生的基础研究中,通过多种技术如细胞移植、基因治疗、细胞内分子信号的修饰和克服再生屏障等研究,证实成年哺乳动物的中枢神经元在受损后确实可以再生,甚至产生靶支配。但脊髓损伤后解剖重建和功能恢复是十分棘手的问题,当前对脊髓损伤后修复研究的主要途径是从促进神经元轴突的再生和组织移植替代两个方面来探讨脊髓修复及功能恢复的可行性。于是,雪旺细胞移植治疗脊髓损伤成为目前国内外研究的热点。现已证实雪旺氏细胞分泌的神经生长因子和细胞外基质,对神经再生具有重要作用。过去十余年,神经科学工作者对雪旺细胞移植治疗脊髓损伤进行了初步的探索,并证实雪旺氏细胞移植可以促进脊髓损伤近端神经元轴突向远端延伸、损伤神经元髓鞘化。但关于雪旺氏细胞的活化、移植方式及移植介质仍在探索之中。目前国内外学者重点从以下几个方面进行研究:对雪旺氏细胞进行基因修饰使之分泌大量神经生长因子以诱导脊髓神经元的再生;神经生长因子基因修饰后的雪旺氏细胞与胶原母细胞按一定比例(5:1)培养于胶原基质中,再植入脊髓损伤处,诱导脊髓神经元再生;将聚乳酸支架制成筒状直接包绕雪旺氏细胞植入脊髓损伤处从而治疗脊髓损伤。同时,学者们对各种脊髓损伤模型也进行了探讨,包括挫伤、不完全损伤、横断损伤等。各种实验在解剖重建和电生理检测方面都得到满意的结果,但运动功能恢复却未见报告。组织工程技术是一门新兴的医学技术,在各个领域已显出巨大的应用前景。早在1995年就有研究人员应用组织工程技术移植雪旺细胞治疗脊髓损伤了,在神经纤维再生方面获得了可喜的成绩,但由于支架材料选择上的欠缺,并未有突破性的研究成果。本研究拟在脊髓损伤的组织工程技术方面进行进一步的探索。现已证实在脊髓横断损伤处移植雪旺氏细胞后,在移植体与脊髓断端接触面之间并无明显的炎症反应,且脊髓两断端之间有有髓神经纤维生长。因此本研究的基本思路是:取外周神经分离、纯化雪旺氏细胞,进行人类NGF(Nerve Growth Factor)基因转染,使能够稳定高效表达NGF,然后将其注入胶原制成的海棉状可吸收生物支架上,一起植入脊髓离断伤处,观察脊髓神经元再生及脊髓传导功能恢复的情况。从而评价应用组织工程技术进行雪旺细胞移植在脊髓横断性损伤中的治疗作用,为脊髓损伤后的治疗作进一步基础及临床研究提供理论基础。在本研究的第一部分,我们应用植块法与消化法相结合的方法进行原代雪旺细胞的培养。以新生SD大鼠的双侧坐骨神经为材,剥去神经外膜,剪成1mm大小的碎块,用0.25%的胰蛋白酶和0.03%胶原酶消化12分钟,然后种植培养,培养基为含10%胎牛血清的DMEM,24小时后用阿糖胞苷去除成纤维细胞,共24小时,以后每2-3天更换培养液。结果显示,在培养的2-6天细胞生长迅速,12天后细胞生长达到高峰。经S-100荧光染色鉴定雪旺细胞,结合Hoechst核染色后可算出原代细胞纯度达95.1%,传一代后细胞纯度更达96.3%,10个新生鼠经过原代培养12天后可以获得大约3.0╳10~6的雪旺细胞。同时发现本方法所培养的雪旺细胞在28天后才开始凋亡,完全能满足组织工程应用的要求。本研究的第二部分中,由Genebank中查得hNGF-β片段的序列,合成引物后成功构建了hNGF-β基因片段,与Genebank中相符合。接着进行慢病毒载体Lentivirus的包装。以Qiagen公司的提取慢病毒包装系统由pGC-E1载体,pHelper 1.0 (gag/pol元件)载体,Helper 2.0 (VSVG元件)载体三质粒组成,其中pGC-E1载体含有CMV启动子驱动的荧光蛋白GFP。可用于病毒包装时转染效率,以及感染宿主细胞的感染效率的检测。将GFP蛋白替换为其他外源基因,或者一同插入外源基因,既可以表达目的基因,又有荧光蛋白检测。Helper 1.0质粒中含有HIV病毒的gag基因,编码病毒主要的结构蛋白; pol基因,编码病毒特异性的酶;rev基因,编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0质粒中含有单纯疱疹病毒来源的VSVg基因,提供病毒包装所需要的衣壳蛋白。以293T细胞为包装细胞,在病毒携带的绿色荧光蛋白的帮助下,很方便的能够观察到重组慢病毒Lentivirus-hNGFβ的产生。应用本方法成功地获得了高滴度的单一重组病毒(2×10~8 TU/ml)。在第三部分的研究中,我们在前两部分的基础上在体外检测了所构建的重组慢病毒载体Lentivirus-hNGFβ对雪旺细胞的感染效率。分别以MOI值为1、5、10、20、40对雪旺细胞进行感染,结果显示当MOI值为10时感染效率最高,可达90%。GFP在雪旺细胞内的表达在感染7天达到高峰。经RT-PCR证实有hNGF mRNA的表达,以山羊抗hNGF抗体行Western Blot实验亦证实了NGF的表达,从而为下一步的体内实验提供了可靠的实验数据。在前面三部分研究的基础上,我们进行了第四部分的体内实验。以雌性SD成鼠为动物模型,在T8-9平面离断脊髓约3cm,以胶原海棉为生物支架植入脊髓离断处,然后将基因修饰的雪旺细胞悬液注入支架上,每个老鼠的细胞植入量约为2×10~6。在移植后1周、1个月、2个月的3个时间段分别取材观察细胞的存活情况、NGF的表达以及支架吸收情况。经荧光显微镜观察显示,雪旺细胞在体内的支架上2个月后仍存活良好,经电镜观察亦证实了雪旺细胞的存活。经免疫组化及Western Blot实验检测到NGF得到了良好的表达,初步说明了该组织工程技术治疗脊髓损伤的可行性。通过以上实验我们成功地在体外培养了原代雪旺细胞,并了解了雪旺细胞的生长规律;成功地构建了慢病毒Lentivirus-hNGF基因载体并在体外检测了Lentivirus-hNGF对雪旺细胞的转染效率。将hNGF基因修饰的雪旺细胞与胶原海棉可吸收生物支架一起植入脊髓离断伤处,雪旺细胞与胶原海棉生物相容性良好,移植2个月后仍存活,而且有NGF基因的表达。为脊髓损伤组织工程技术又提供了一个新的理论依据,下一步我们将继续研究植入体内的雪旺细胞与胶原海棉对神经再生的作用以及神经功能的恢复情况。