Nisin是一种由乳酸乳球菌产生分泌的抗菌多肽,其分子内部含有5个硫酯环,因而被称为羊毛硫抗生素。Nisin能够有效抑制多种革兰氏阳性细菌,同时由于其对哺乳动物及人类均无毒害作用,因而长期在世界范围内被广泛用作食品防腐剂。NisP属于丝氨酸蛋白酶中的枯草杆菌酶家族,其作为nisin的前导肽酶,通过切除nisin前体中的前导肽而在nisin的最终成熟中起重要作用。乳酸乳球菌LAC71中,nisP基因部分缺失后,表达功能失活的NisP蛋白,导致携带有前导肽的未成熟nisin的产生。本文通过结构生物学手段,纯化并结晶了硒代NisP蛋白催化结构域部分,收集了其1.10A的衍射数据并解析了其高分辨率的晶体结构。文章首先将NisP与其同源蛋白结构进行了比较,表明与其他枯草杆菌酶家族成员有较高的同源性,均具有保守的催化三联体结构,利用活性位点的丝氨酸残基对蛋白质中的肽键进行亲核攻击而造成蛋白质的水解。通过对催化三联体中的His306和Ser512进行突变,证明这两个氨基酸残基在NisP催化活性中的重要作用。不同于其他枯草杆菌酶家族成员,在解析的结构中,除了包含NisP催化结构域部分外,还结合有NisP自身C末端的一小段多肽序列。观察后发现该多肽C末端残基恰位于NisP催化活性位点,表明该多肽可能是由NisP切割产生。通过体外合成包含剪切位点在内的荧光标记多肽进行酶活测试、Western blot实验以及质谱实验分析,证实NisP具有识别其C末端序列并进行剪切的活性,继而通过突变实验对NisP蛋白C末端自剪切位点进行了确定。在NisP蛋白的C末端区域存在LPXTGX序列,在许多革兰氏阳性细菌中,该序列与蛋白的细胞表面定位相关,NisP蛋白中C末端自剪切位点位于该序列之前,因而该C末端自剪切行为可能与NisP从细胞表面的释放有关。为探索NisP中这种C末端自剪切行为的确切生物学意义,进一步设计了C末端不能剪切的NisP突变体R647P/S648P。利用酶活实验和抑菌实验分析了NisP蛋白C末端不能剪切对NisP活性的影响。已知在许多枯草杆菌酶家族成员的结构中,结合有不同数目的钙离子,但在解析的NisP结构中并没有观察到钙离子的存在。根据之前文献预测的NisP蛋白中可能的钙离子结合位点,进行结构上分析,显示该位点处氨基酸残基主要呈线状分布,没有形成很好的金属离子配位体系,因而该位点处未能结合钙离子。同时测定了不同钙离子浓度下NisP蛋白对合成底物的切割活性,结果显示钙离子对NisP蛋白活性没有明显影响,表明NisP蛋白可能是一种钙离子非依赖性的丝氨酸蛋白酶。本论文研究有助于在分子层面理解NisP在nisin前体前导肽、NisP成熟过程中其自身N末端前肽序列及其C末端序列中的剪切活性,对NisP底物选择机制有了进一步理解,并为研究NisP在细胞表面的定位及发生剪切后从细胞表面的释放提供了线索。本研究将推进基于NisP作用机理的nisin高产菌株的改造及获得。全文含有图68幅,表5个,参考文献129篇。