何首乌为我国传统中药,近年来有关其肝毒性报道日益增多,为减少药物毒副作用,确保临床用药安全,本论文以何首乌为研究对象,通过免疫应激模型从体内体外试验探究其主要毒性物质基础、建立各部位指纹图谱明确质量控制标准要求。主要研究内容如下:1.何首乌肝毒性部位的筛选目的:明确何首乌肝毒性主要部位方法:通过LPS建立细胞免疫应激模型,MTT检测不同部位药材(生品、炮制品、水洗部位、50%乙醇部位、95%乙醇部位)对L-02细胞(正常人肝细胞)的抑制率、流式细胞术检测细胞凋亡、ELISA试剂盒检测培养液上清中ALT、AST含量;采用LPS建立免疫应激大鼠动物模型,试验分为18组,以灌胃的方式给予不同剂量药物,观察肝脏指数、血清中ALT、AST、LDH释放率、肝脏病理学改变。结果:在此模型下,体外试验表明当浓度为400μg·mL-1时,50%乙醇部位细胞抑制率、凋亡率、细胞上清液ALT、AST含量都最高;体内动物试验中50%乙醇部位能显著增加大鼠肝脏指数、提高血清中ALT、AST、LDH释放率、肝脏有病理学改变。结论:结合体内体外试验,在免疫应激模型下,诱导何首乌肝毒性的部位为50%乙醇部位。2.何首乌肝毒性物质基础的验证目的:进一步筛选何首乌的主要毒性单体,对毒性物质基础验证方法:通过提取分离得到50%乙醇部位中主要化合物二苯乙烯苷(TSG),利用LPS建立细胞免疫应激模型,MTT检测不同浓度TSG对L-02细胞的抑制率、流式细胞术检测细胞凋亡、ELISA试剂盒检测培养液上清中ALT、AST含量;采用LPS建立免疫应激大鼠动物模型,试验分为16组,以灌胃的方式给予不同剂量药物,观察肝脏指数、血清中ALT、AST、LDH释放率、肝脏病理学改变。结果:随着TSG浓度的升高,细胞抑制率和凋亡率、细胞上清液中ALT、AST含量都升高。TSG能使动物肝脏指数增大,血清中ALT、AST、LDH释放率增高。肝细胞内药物沉积,炎症因子增加,肝脏代谢能力减弱,肝细胞有坏死趋向。结论:二苯乙烯苷在免疫应激条件下可诱导肝毒性,但二苯乙烯苷存在顺式和反式结构,其主要毒性基础还有待进一步验证。3.何首乌质量控制研究目的:建立不同部位指纹图谱考察生品与炮制品间差异方法:采用超高效液相色谱分析,Waters ACQUITY UPLC@BEHC18色谱柱(2.1×50mm,1.7 μm),乙腈-0.5%甲酸溶液梯度洗脱,流速0.3mL·min-1,波长254 nm,柱温25±5 ℃,建立不同产地何首乌50%乙醇部位UPLC指纹图谱;采用高效液相色谱分析,Agilent ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm,5μm),甲醇-0.05%甲酸溶液梯度洗脱,流速1mL·min-1,波长280nm,柱温25±5℃,建立不同产地何首乌95%乙醇部位HPLC指纹图谱。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》、SPSS22.0软件、SIMCA13.0软件对不同部位色谱进行相似度分析、聚类分析及主成分分析,寻找主要差异性成分并进行含量测定。结果:建立35批不同产地生、制何首乌50%乙醇部位和95%乙醇部位指纹图谱,相似度评价显示各部位间生品差异性较小,相似度均在0.8以上,炮制品受炮制工艺的不同差异较大;聚类分析基本可将两个部位药材分为生、制何首乌两类;主成分分析可知导致50%乙醇部位主要差异成分为二苯乙烯苷,95%乙醇部位的差异成分为大黄素和大黄素甲醚;正是由于某些产地炮制品中二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚含量较高被分在生首乌一类。从化学成分上反映了不同产地炮制方法的相似性及差异性。结论:建立不同部位指纹图谱及测定方法,明确不同部位主要差异性成分为二苯乙烯苷和大黄素、大黄素甲醚,炮制品化学成分差异较大,提示应规范何首乌的炮制工艺。此方法简单,灵敏,可靠,可用于生/制何首乌的快速鉴别,可作为何首乌药材整体质量控制的方法之一。