胰腺干细根据是一类存在于胎儿和成体胰腺组织中的成体干细胞，能够自我更新，并具有向三胚层细胞分化的潜能。根据在胰腺组织中的存在部位不同，胰腺干细胞分为三类，其中，存在于胰岛部位的干细胞称为胰岛干细胞，存在于导管部位的干细胞称为胰腺导管干细胞，存在于腺泡部位的干细胞则称为腺泡干细胞。胰腺干细胞能用于探讨动物和人胰腺组织细胞的生长发育，还能作为种子细胞并诱导分化形成功能性胰岛移植治疗糖尿病，具有重要的意义。但是，有关胰岛干细胞和胰腺导管干细胞分化潜能特别是分化形成功能性胰岛的比较研究未见报道。　　本实验室已从成年大鼠胰岛、胰腺导管组织分离培养大鼠胰岛干细胞系和胰腺导管干细胞系，并对其形态学特征、生物学表达特性、细胞周期、细胞核型等进行了研究，但是，有关这两个干细胞系的多分化潜能还有待于研究。本研究以实验室现有的大鼠胰岛干细胞系和胰腺导管干细胞系为材料，拟体外定向诱导其分化形成神经细胞、成骨细胞、脂肪细胞及胰岛细胞并进行比较，为证实这两个干细胞系具有多分化潜能，为进一步筛选出易分化形成功能性胰岛的干细胞系提供依据。　　研究的主要内容包括：　　（1）诱导大鼠胰岛干细胞、胰腺导管干细胞分化形成神经样细胞的比较研究　　本研究体外定向诱导大鼠胰岛干细胞、胰腺导管干细胞分化形成神经细胞，并对两种细胞诱导分化能力进行比较。以随机解冻大鼠胰岛干细胞、胰腺导管干细胞为材料，采用RPMI-1640+15%NBS培养液扩增培养，待细胞生长至80%融合，进行诱导试验。试验共分3组，每组胰岛干细胞、胰腺导管干细胞各1块板，各6个重复。试验1组添加β-巯基乙醇诱导液；试验2组添加大鼠全脑组织提取液诱导液；对照组添加H-DMEM+10%NBS，诱导培养8d，每隔4h观察细胞。根据细胞形态变化，筛选诱导效果较好的诱导液。在此基础上，进一步探讨筛选出诱导液不同浓度的诱导效果。随机选择胰岛干细胞、胰腺导管干细胞扩增培养，待细胞生长至80%融合后，开始诱导试验。试验共分4组，每组胰岛干细胞、胰腺导管干细胞各1块板，各6个重复。试验1组添加5mg/mL大鼠全脑组织提取液诱导液；试验2组添加10mg/mL大鼠全脑组织提取液诱导液；试验3组添加15mg/mL大鼠全脑组织提取液诱导液；对照组添加H-DMEM+10%NBS，连续诱导8d，每隔2d观察细胞。根据细胞形态变化，筛选诱导效果较好的浓度。最后， 探讨优化诱导液对两种干细胞分化形成神经细胞的影响。随机选择胰岛干细胞、胰腺导管干细胞按照1×105个/cm2密度做细胞爬片，待细胞生长至80%融合，开始诱导试验。每组胰岛干细胞、胰腺导管干细胞各1块板，各6个重复。试验组添加5mg/mL大鼠全脑组织提取液诱导液；对照组添加H-DMEM+10%NBS，连续诱导8d，每隔2d观察细胞。试验结束时，对两种诱导后细胞进行NSE 免疫荧光染色。　　结果显示，不同诱导液诱导结果中大鼠脑组织提取液处理组诱导两种干细胞分化形成神经细胞效果明显。诱导细胞神经元突触明显，相互细胞突触间发生联系；添加β-巯基乙醇处理组诱导细胞未见神经样变化。添加不同浓度大鼠脑组织提取液诱导结果显示5mg/mL脑组织提取液处理组效果最明显，胰岛干细胞诱导阳性率为 75%，胰腺导管干细胞阳性率为 40%。优化诱导液诱导细胞结果显示胰岛干细胞诱导细胞形态变化更清楚、完整，细胞由多边形向不规则的锥形或是星形转变，干细胞日益成熟，细胞体进行收缩，折光性增强。最后形成完整的神经样结构。NSE 免疫荧光反应，两种干细胞胞浆都出现阳性表达，胰岛干细胞阳性表达率更高。综上，胰岛干细胞比胰腺导管干细胞更易分化形成神经样细胞。　　（2）诱导大鼠胰岛干细胞、胰腺导管干细胞分化形成成骨细胞的比较研究　　本研究体外定向诱导大鼠胰岛干细胞、胰腺导管干细胞分化形成成骨细胞，并对两种细胞诱导分化能力进行比较。以随机解冻胰岛干细胞、胰腺导管干细胞为材料，采用RPMI-1640+15%NBS培养液扩增培养，待细胞生长至80%融合，开始诱导试验。试验共分3组，每组胰岛干细胞、胰腺导管干细胞各1块板，各6个重复。试验1组添加0.1umol/L地塞米松、10mmol/Lβ-磷酸甘油、50ug/mL抗坏血酸盐组成的诱导液；试验2组添加8mg/mL大鼠脑灰质组织提取液诱导液；对照组添加RPMI-1640+10%NBS，连续诱导28d，每隔2d观察细胞。根据细胞形态的变化，筛选出诱导效果较好的诱导液。在此基础上，进一步探讨优化的诱导液对分化细胞形成骨盐能力的影响。随机选择胰岛干细胞、胰腺导管干细胞扩增培养，待细胞生长至80%融合，开始诱导试验。每组胰岛干细胞、胰腺导管干细胞各1块板，各6个重复，试验组添加由0.1umol/L地塞米松、10mmol/Lβ-磷酸甘油、50ug/mL抗坏血酸盐组成的诱导液；对照组添加RPMI-1640+10%NBS，连续诱导 28d，每隔 2d 观察细胞。试验结束时，对两组诱导后细胞分别进行茜素红、Vonkossa染色。　　结果显示，不同诱导液诱导结果中地塞米松、抗坏血酸盐、β-磷酸甘油处理组诱导效果最好，诱导细胞分泌细胞基质形成明显的矿化结节；大鼠脑灰质处理组诱导细胞分泌细胞基质形成单层片状结节，散在分布在细胞表面。优化诱导培养液诱导结果显示，胰岛干细胞诱导细胞效果更好，诱导细胞分泌细胞基质形成矿化结节，结节层叠生长逐渐形成圆球状、岛状。诱导结束后，胰岛干细胞、胰腺导管干细胞茜素红染色反应阳性，阳性率分别是 60%和 35%。Vonkossa 染色反应呈阳性，阳性率分别为 45%和 40%。细胞诱导过程中，胰岛干细胞内细胞生长增殖稳定，细胞视野干净、杂质较少，更利于细胞进行诱导分化。综上，胰岛干细胞比胰腺导管干细胞更易分化形成成骨细胞。　　（3）诱导大鼠胰岛干细胞、胰腺导管干细胞分化形成脂肪样细胞的比较研究　　本研究体外定向诱导大鼠胰岛干细胞、胰腺导管干细胞分化形成脂肪细胞，并对两种细胞诱导分化能力进行比较。以随机解冻胰岛干细胞、胰腺导管干细胞为材料，采用RPMI-1640+15%NBS培养液扩增培养，待细胞生长至80%融合，开始诱导试验。试验共分3组，每组胰岛干细胞、胰腺导管干细胞各1块板，各6个重复。试验1组添加由1umol/L地塞米松、1ug/L胰岛素、0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基嘌呤（IBMX）组成诱导液；试验2组添加由4mg/mL大鼠附睾脂肪提取液组成诱导液；对照组添加H-DMEM+10%NBS，连续诱导28d，每隔2d观察细胞。根据细胞形态的变化，筛选出诱导效果较好的诱导液。在此基础上，进一步探讨优化的诱导液对分化细胞形成脂肪能力的影响。随机选择胰岛干细胞、胰腺导管干细胞扩增培养，待细胞生长至80%融合，开始诱导试验。每组胰岛干细胞、胰腺导管干细胞各1块板，各6个重复，试验组添加由1umol/L地塞米松、1ug/L胰岛素、0.5mmol/LIBMX组成诱导液；对照组添加H-DMEM+10%NBS，连续诱导28d，每隔2d观察细胞。试验结束时，对诱导后细胞进行油红O染色。　　结果显示不同诱导液诱导结果中地塞米松、胰岛素、IBMX 组成的处理组诱导细胞形成脂肪细胞阳性率更高，细胞内出现大小不一脂滴，分布不均匀；大鼠附睾脂肪提取液处理组诱导细胞内脂滴量少，大小均一。优化诱导培养基诱导结果显示胰岛干细胞诱导细胞内脂滴较多，分散在细胞内；胰腺导管干细胞诱导细胞脂滴较少，主要分布在细胞膜的周围。28天时，油红O染色诱导细胞，两种干细胞染色阳性，阳性率分别是 85%和 60%。胰岛干细胞诱导脂滴阳性率高于胰腺导管干细胞，且诱导细胞红染明显。综上，胰岛干细胞比胰腺导管干细胞更易诱导形成脂肪细胞。　　（4）诱导大鼠胰岛干细胞、胰腺导管干细胞分化形成胰岛的比较研究　　本研究体外定向诱导大鼠胰岛干细胞、胰腺导管干细胞分化形成功能性胰岛，并对两种干细胞诱导分化能力进行比较。以随机解冻胰岛干细胞、胰腺导管干细胞为材料，采用RPMI-1640+15%NBS培养液扩增培养，待细胞生长至80%融合，开始诱导试验。试验共分 6 组，每组胰岛干细胞、胰腺导管干细胞各 1块板，各 6 个重复。试验 1 组添加 10.6mmol/L 葡萄糖诱导液；试验 2 组添加15.6mmol/L葡萄糖诱导液；试验3组添加20.6mmol/L葡萄糖诱导液；试验4组添加25.6mmol/L葡萄糖诱导液；试验5组添加30.6mmol/L葡萄糖诱导液；对照组添加L-DMEM+10%NBS，连续诱导28d，每隔2d观察细胞。试验结束时，观察细胞形态，筛选出适宜的葡萄糖浓度。随机选择胰岛干细胞、胰腺导管干细胞扩增培养，待细胞生长至80%融合，开始诱导试验。试验共分5组，每组胰岛干细胞、胰腺导管干细胞各1块板，各6个重复。试验1组添加5mmol/L尼克酰胺诱导液；试验2组添加10mmol/L尼克酰胺诱导液；试验3组添加15mmol/L尼克酰胺诱导液；试验 4 组添加 20mmol/L 尼克酰胺诱导液；对照组添加L-DMEM+10%NBS，连续诱导28d，每隔2d观察细胞。根据细胞形态变化选择出最适宜的尼克酰胺浓度。随机选择胰岛干细胞、胰腺导管干细胞扩增培养，待细胞生长至80%融合，开始诱导试验。试验共分4组，每组胰岛干细胞、胰腺导管干细胞各 1 块板，各 6 个重复。试验 1 组添加 15.6mmol葡萄糖、10mmol/L尼克酰胺联合诱导液；试验2组添加20.6mmol葡萄糖、10mmol/L尼克酰胺联合诱导液；试验3组添加25.6mmol葡萄糖、10mmol/L尼克酰胺联合诱导液；对照组添加L-DMEM+10%NBS，连续诱导28d，每隔2d观察细胞。试验结束过程中，观查细胞形态变化，筛选出优化的诱导培养体系。在此基础上，进一步探讨优化的诱导体系对两种干细胞分化形成β细胞功能的影响。随机选择胰岛干细胞、胰腺导管干细胞扩增培养，待细胞生长至 80%融合，开始诱导试验。试验共分 2组，每组胰岛干细胞、胰腺导管干细胞各 1 块板，各 6 个重复。诱导组添加25.6mmol 葡萄糖、10mmol/L 尼克酰胺联合诱导液，对照组添加L-DMEM+10%NBS，连续诱导28d，每隔2d观察细胞。试验结束时，对诱导后细胞进行DTZ染色和糖刺激释放胰岛素试验。　　结果显示，不同浓度葡萄糖诱导结果中15.6 mmol葡萄糖处理组、20.6 mmol葡萄糖处理组、25.6 mmol葡萄糖处理组都能诱导胰岛干细胞和胰腺导管干细胞分化形成胰岛样细胞，细胞聚集生长形成直径大小不一细胞团。10.6 mmol葡萄糖处理组、30.6mmol 葡萄糖处理组未见明显变化。不同浓度尼克酰胺诱导液诱导结果显示，10 mmol/L尼克酰胺试验组细胞增殖速度较快。5 mmol/L尼克酰胺试验组、15 mmol/L尼克酰胺试验组、20 mmol/L尼克酰胺试验组出现抑制细胞增殖并促进细胞凋亡的现象。葡萄糖、尼克酰胺联合诱导结果显示，25.6mmol葡萄糖、10mmol/L 尼克酰胺联合诱导试验组产生的胰岛样细胞团最多，胰岛细胞团形态完整。优化诱导培养基诱导结果显示，胰岛干细胞诱导细胞逐渐由多边形变为球形，由贴壁生长变为聚集生长并形成不同直径的细胞团，细胞团内细胞分化成熟、核质比缩小、细胞器丰富；胰腺导管干细胞进入诱导过程较晚，诱导阳性率低。两种干细胞分化形成胰岛双硫腙（DTZ）染色呈红色，加 5.5mM 低糖或 25mM 高糖刺激液，培养 2h,胰岛素量释放量分别为 0.414±0.07ng/mL、0.483±0.15ng/mL 和 0.401±0.05ng/mL、0.469±0.1ng/mL。胰岛干细胞刺激指数（1.166±0.022a）大于胰腺导管干细胞（1.156±0.018a）。比较两种干细胞的诱导速率和诱导产物的生物学功能，以及在糖刺激试验中的刺激指数，胰岛干细胞比胰腺导管干细胞更易分化形成功能性胰岛。