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硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是继一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)之后的第三种气体信号分子,具有广泛的生理功能,参与调节血管舒张与收缩,但其舒张血管机制尚不明确。小G蛋白RhoA及其下游效应分子Rho相关的卷曲螺旋激酶(Rho associated coiled coil-forming kinase, ROCK)参与包括脑缺血在内的多种疾病的发生,对多种类型的血管平滑肌细胞收缩具有调节作用。缺血性脑血管病是临床上的常见病,严重危害人类健康和社会的发展。金丝桃苷(hyperin, Hyp)属黄酮醇苷类化合物,广泛存在于多种植物中,本实验室前期研究发现Hyp对小鼠脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤有明显的保护作用,但其抗脑缺血损伤作用机制尚不明确,体外血管舒缩功能实验表明Hyp可舒张大鼠脑基底动脉(basilar arteries, BAs)且其舒张作用与内源性H2S有关。本文通过建立内源性H2S合成酶胱硫醚-Y-裂解酶(cystathionine y-lyase, CSE)基因敲除(CSE knockout, CSE-KO)小鼠模型和离体血管张力测定实验观察H2S及RhoA-ROCK通路在小鼠BAs舒缩功能中的作用,并通过建立小鼠脑I/R模型来探讨H2S在Hyp抗小鼠脑I/R损伤中的作用。实验目的：1.研究 H2S诱导的小鼠BAs舒张与RhoA-ROCK通路的关系；2.探讨H2S在Hyp抗小鼠脑I/R损伤中的作用。实验方法：1.离体血管张力测定实验记录小鼠BAs张力变化：观察RhoA激动剂LPA和U46619对WT和CSE-KO小鼠BAs张力的影响；ROCK抑制剂Y27632对WT和CSE-KO内皮完整及内皮去除的BAs张力的影响；观察Y27632对NaHS诱导的BAs舒张的影响。2.原代培养小鼠BAs平滑肌细胞,并用免疫荧光法进行鉴定；3.用G-LISA法检测H2S对小鼠BAs平滑肌细胞RhoA活性的影响；4.用Western blot法检测H2S对小鼠BAs平滑肌细胞ROCK1、ROCK2蛋白表达的影响；5.双侧颈总动脉结扎法建立CSE-KO及野生型(wide type, WT)小鼠脑I/R模型来探讨H2S在Hyp抗小鼠脑I/R损伤中的作用；通过检测小鼠脑组织乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量观察各组小鼠脑组织损伤情况；用小鼠跳台实验和水迷宫实验观察各组小鼠学习记忆能力。实验结果：1.RhoA的两种激动剂LPA (10～160μmol/L)和U46619(10-9～10-6 mol/L)均能够浓度依赖性地收缩WT小鼠BAs；2.在CSE-KO小鼠BAs上,LPA (10～160μmol/L)和U46619 (10-9～10-6 mol/L)诱导的收缩作用明显增强；3. ROCK抑制剂Y27632 (10-7～10-5 mol/L)能够浓度依赖性地舒张小鼠BAs,血管内皮去除后Y27632诱导的小鼠BAs舒张作用减弱；4.在CSE-KO小鼠BAs上,Y27632 (10-7～10-5mol/L)诱导的小鼠BAs舒张作用明显减弱；5.外源性H2S供体NaHS (10-6～10-3 mol/L)诱导的舒张作用被ROCK抑制剂Y27632 (3μmol/L)减弱；6.RhoA激动剂LPA (10μmol/L)及CSE基因敲除明显诱导小鼠BAs平滑肌细胞RhoA活性增高,NaHS 100μmol/L、200μmol/L可明显抑制CSE-KO小鼠BAs平滑肌细胞RhoA活性；7.RhoA激动剂LPA及CSE基因敲除能明显增加小鼠BAs平滑肌细胞ROCK1和ROCK2蛋白表达,ROCK抑制剂Y27632 (1μmol/L)和NaHS (100μmol/L、200 μmol/L)可明显降低CSE-KO小鼠平滑肌细胞ROCK1和ROCK2蛋白的表达；8.脑I/R后WT小鼠脑组织LDH活性显著下降,MDA含量显著升高,CSE-KO小鼠脑组织LDH活性下降及MDA含量升高更为明显,Hyp 50mg/kg、100mg/kg能抑制由于脑I/R导致的WT小鼠脑组织LDH活性下降及MDA含量升高,但对CSE-KO小鼠无抑制作用。9.在小鼠跳台实验中,脑I/R后WT小鼠学习潜伏期延长、记忆潜伏期缩短、学习与记忆错误次数均增多,CSE-KO小鼠以上指标改变更为明显；Hyp 50 mg/kg、 100 mg/kg能抑制由于脑I/R导致的WT小鼠以上指标的改变,但对脑I/R后的CSE-KO小鼠以上指标无明显改善作用。10.在水迷宫实验中,脑I/R后WT小鼠逃避潜伏期延长,穿过原平台次数、原平台象限游程比率及原平台象限时间比率均显著减少,CSE-KO小鼠以上指标改变更为明显；Hyp 50 mg/kg、100 mg/kg能抑制由于脑I/R导致的WT小鼠以上指标的改变,但对脑I/R后的CSE-KO小鼠无抑制作用。11. NaHS能抑制脑I/R后WT小鼠脑组织LDH活性的下降及MDA含量的升高并促进WT脑I/R小鼠学习记忆能力。结论：1.H2S对小鼠BAs的舒张作用与抑制RhoA-ROCK通路有关；2.Hyp抗小鼠脑I/R损伤与增加CSE合成的H2S有关。