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葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,GOX)是一种需氧脱氢酶,对生物体无毒,无副作用,能利用葡萄糖氧化成葡萄糖酸而有效除氧。其在动物、植物以及微生物中广泛存在。与真菌GOX相比,有关昆虫GOX性质和功能的研究,显得非常有限。近期研究发现还发现GOX在昆虫与植物相互关系中起着至关重要的作用。
本文主要通过家蚕全基因组序列、基因芯片、EST数据,对家蚕编码葡萄糖氧化酶GOX的两个候选基因Bmgox63和.Bmgox72进行了克隆和原核表达。
获得了以下的结果:
(1)克隆出了家蚕的GOX基因的两个基因,并进行了序列分析。
通过基因序列分析和氨基酸预测,我们得到Bmgox63基因ORF全长1,710bp,编码566个氨基酸,预测蛋白的分子量大小为63kDa,等电点为5.99。Bmgox72基因ORF全长1,830bp,编码606个氨基酸,预测蛋白的分子量大小为65kDa,等电点为5.44。它们位于家蚕的第16号染色体上的nscaf3058。
(2)原核表达了这两个基因获得了大量的蛋白,并正确制备了这两个基因的抗体。
将两个基因编码区亚克隆到pET-28a(+)表达载体,转化到BL21表达菌株,诱导蛋白表达,并纯化蛋白。以纯化的蛋白制备抗体,Western blotting检测到了表达的蛋白,证明抗体制备是正确的。
(3)研究了Bmgox63和Bmgox72这两个基因在家蚕各个组织和时期的表达情况。
通过基因水平的表达谱,Bmgox63其总体的表达量偏低,几乎不表达。Bmgox72基因在家蚕的各个组织和时期中均有或强或弱的表达。其中在时期表达谱中,五龄三天以后的表达量明显升高。组织表达谱发现Bmgox72基因在各个组织中都可以检测得到微量的表达。而在雄性丝腺和雌性丝腺的表达量则明显高于其他组织。通过制备的抗体,从蛋白水平中检测到了这两种基因的表达情况。在蛋白水平上,Bmgox63在家蚕各个组织蛋白中都没有表达;而Bmgox72在丝腺中表达量明显。
通过实验结果,我们推测,Bmgox72就是家蚕的GOX基因,而Bmgox63基因可能在漫长的进化过程中丢失了功能。