论文部分内容阅读
目的:研究氧化苦参碱(Oxymatrine,OMT)对醛固酮(Aldosterone,ALD)诱导体外培养SD新生大鼠心肌成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)向肌成纤维细胞(myofibroblast)转分化模型的抑制作用,探讨其可能的作用机制。方法:采用0.08%胰酶消化出生1-2 d的SD大鼠心脏组织,经1.5 h差速贴壁后获取CFs进行原代培养,于倒置显微镜观察细胞形态。采用波形蛋白(vimentin)免疫细胞化学法鉴定CFs。采用Nrf2激动剂姜黄素(curcumin)和Nrf2 siRNA探讨OMT干预ALD诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化与Nrf2的关系。采用MTT法测定ALD诱导心肌成纤维细胞增殖的最佳浓度-效应和时间-效应,与此同时测定不同浓度的OMT、螺内酯(Spiro)和姜黄素(curcumin)对ALD诱导CFs增殖的影响;实验共分6组,对照组(Control,无血清DMEM),ALD组(ALD,0.1μmol/L),OMT低剂量组(OMT-L,OMT 18.9μmol/L+0.1μmol/L ALD),OMT高剂量组(OMT-H,OMT 37.8μmol/L+0.1μmol/L ALD),螺内酯组(Sprio1μmol/L+0.1μmol/L ALD),姜黄素组(curcumin 10μmol/L+0.1μmol/L ALD)。Nrf2 siRNA转染CFs(脂质体Lipofectamin 2000转染)实验分为空白对照组(Control,无血清DMEM),阴转对照组(negative control,NC),ALD组(ALD,0.1μmol/L),OMT-H(OMT 37.8μmol/L+0.1μmol/L ALD),转染组(Nrf2siRNA+0.1μmol/L ALD),转染+OMT-H组(Nrf2 siRNA+0.1μmol/L ALD+37.8μmol/L OMT-H)。Gimsa染色观察各组CFs形态学变化;划痕试验(scratch assay)进行细胞迁移能力分析。采用流式细胞术进行细胞周期(Cell cycle)测定。采用羟脯氨酸试剂盒测定各组细胞培养上清液中羟脯氨酸含量。Western blot检测I型胶原(Collagen I)、III型胶原(Collagen III)、纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)、结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)、α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)、盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor,MR)、核Nrf2、浆Nrf2、浆Keap1、HO-1(Heme oxygenase-1)蛋白表达。采用免疫荧光染色法观察a-SMA蛋白的表达。RT-PCR分析Nrf2 mRNA的表达。用Nrf2 siRNA研究Nrf2在OMT处理的CFs中的作用。采用试剂盒测定谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。用荧光探针2’、7’-二氯荧光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)检测活性氧(ROS)水平。结果:倒置显微镜下观察CFs排列紧密,呈梭形或多角形,无自发搏动;波形蛋白免疫细胞化学法鉴定显示CFs纯度大于95%;MTT法确定ALD最佳造模浓度为0.1μmol/L作用24 h;OMT-H、OMT-L、MR抑制剂螺内酯(Sprio)和Nrf2激动剂姜黄素组(curcumin)可抑制ALD所诱导的CFs增殖。Gimsa染色结果CFs的细胞核为蓝紫色,细胞浆为淡粉色。与Control组比较,ALD组细胞数量增多,细胞间隙紧密。OMT-H、OMT-L、Sprio、curcumin组与ALD组相比细胞数量减少,细胞间隙增大。划痕实验结果显示,与Control组比较,ALD组CFs的迁移能力明显提高;与ALD组比较,OMT-H、OMT-L、Sprio、curcumin组能够明显抑制ALD诱导CFs的迁移能力。细胞周期实验结果显示,与Control组比较,ALD组S期细胞分布比率显著增加;OMT-H、OMT-L、Sprio、curcumin组能够明显抑制ALD诱导S期细胞分布比率。羟脯氨酸含量测定结果显示ALD可以诱导胶原的分泌,羟脯氨酸含量升高。与ALD组比较,OMT-H、OMT-L、Sprio及curcumin组均能抑制ALD诱导的羟脯氨酸含量升高。Western Blotting实验结果显示,与Control组比较,ALD组中的collagen I、collagen III、FN、CTGF、α-SMA、MR蛋白表达上调,与ALD组相比,OMT-H、OMT-L、Sprio及curcumin组均能够抑制collagen I、collagen III、FN、CTGF、α-SMA、MR蛋白的表达;在荧光显微镜下,α-SMA的免疫荧光染色也有类似的趋势。Western Blotting实验结果显示,与Control组比较,ALD使核Nrf2、HO-1蛋白表达下调,浆Nrf2、浆Keap1的蛋白表达上调。与ALD组比较,OMT-H、OMT-L、Sprio及curcumin组中核Nrf2、HO-1蛋白表达上调,而浆Nrf2、浆Keap1的蛋白表达下调。而curcumin组和OMT+curcumin组之间核Nrf2、浆Nrf2、浆Keap1、HO-1蛋白表达无明显差异。实时荧光定量PCR(RT-PCR)结果显示ALD诱导Nrf2 mRNA表达减少,与ALD组相比,OMT-H、OMT-L、Sprio及curcumin组可以增加Nrf2 mRNA表达。Nrf2 siRNA转染CFs后其转染效率为60.15%;OMT显著减少ALD诱导α-SMA、collagen I、collagen III、CTGF蛋白表达增加;然而,Nrf2 siRNA逆转了OMT减少collagen I、collagen III、CTGF、α-SMA蛋白表达的作用,且Nrf2 siRNA与OMT+Nrf2 siRNA组比较无显著性差异。在荧光显微镜下,α-SMA的免疫荧光染色也有类似的趋势。荧光探针DCFH-DA检测结果显示,ALD显著增加CFs细胞中的ROS水平,如活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC),预处理OMT-H、OMT-L、Sprio及curcumin显著降低ALD诱导的ROS水平。不同试剂盒测定的结果显示,与Control组比较,ALD组的MDA含量显著增加,GSH含量和SOD活性显著减低;而预处理OMT-H、OMT-L、Sprio及curcumin显著降低ALD诱导MDA含量的增加,增加ALD降低的GSH水平和SOD活性;结论:OMT可以抑制ALD诱导的心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化,其机制与激活Keap1/Nrf2通路有关。