牛消化道Ⅰ型肽载体(bPepTⅠ)蛋白表达量的检测有助于小肽吸收营养学重要性的研究。本研究应用原核表达重组技术制备bPepTⅠ的多克隆抗体,以用于其蛋白表达量的免疫学测定。用DNAStar软件对bPepTⅠ的DNA全序列进行了抗原性指数分析,并结合该蛋白的跨膜结构,从胞外环筛选出高抗原性指数片段(bPepTⅠORF的1369-1695bp片段)。取牛瘤胃组织样品,用Trizol法提取总RNA,以反转录得到的cDNA为模板,采用PCR扩增技术,扩增得到与预期大小相符的片段,命名为BP片段。将该片段与原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a连接,得到的正确重组质粒分别命名为GST-BP和His-BP。采用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切及测序方法双重鉴定重组质粒的正确性,结果表明,目的片段已定向克隆到原核表达载体上,且克隆的BP基因片段与Genbank登录的标准序列有较高的同源性(99.1%),不会影响后续的蛋白表达工作。用鉴定正确的GST-BP重组质粒转化BL21菌株,His-BP重组质粒转化原核表达菌株BL21(DE3)。IPTG在不同时间和浓度下诱导GST-BP/BL21转化菌株GST-BP/BL21外源蛋白的表达,诱导的重组菌处理后经SDS-PAGE电泳确定IPTG最佳诱导条件。最佳条件下大量诱导GST-BP在BL21菌株中的表达,同时进行重组载体His-BP在BL21(DE3)菌株中的诱导表达,应用SDS-PAGE电泳和Westernblot方法相结合鉴定转化菌株表达蛋白的准确性,结果表明,GST-BP/BL21表达得到38.1kDa左右的蛋白,His-BP/BL21(DE3)表达得到31kDa左右的蛋白,与预期的蛋白分子量大小相符,因此,试验成功获得表达目的蛋白的重组菌株。培养GST-BP/BL21重组菌株,超声波破碎菌体后确定表达蛋白的可溶性,结果表明,重组蛋白以包涵体的形式存在。包涵体蛋白电泳后,切下目的蛋白带所在的胶条免疫小鼠,加强免疫3次后,小鼠尾静脉采血,获得目的蛋白的抗血清。首先用His-BP融合蛋白做抗原,免疫印迹方法鉴定抗体的特异性,结果表明,本研究获得了抗bPepTⅠ目标片段的抗体。接着用不同浓度的GST-BP蛋白为包被抗原,不同稀释度的抗血清做一抗,间接ELISA测定最佳工作条件结果表明,GST-BP抗原最佳包被浓度是0.5μg/mL,抗血清的最佳稀释度是1:400。用包被缓冲液将GST-BP抗原稀释至0.5μg/mL,鼠疫抗血清按1:400,1:1600,1:6400,1:25600,1:102400,1:409600,1:1638400用PBS稀释,间接ELISA分析表明抗血清的效价达到1:102400。