西葫芦黄皮基因精细定位

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西葫芦果皮颜色较为丰富,有白皮、绿皮、黄皮和花皮等多种表型。其中黄皮西葫芦因富含类胡萝卜素而引起了生产者和消费者的广泛关注。但是到目前为止,关于黄皮西葫芦的类胡萝卜素积累分子机制研究甚少,尤其是黄皮基因定位仍然未知。本研究通过构建F2代分离群体、BSA-seq、分子标记开发鉴定等,进行西葫芦黄皮基因的精细定位以及候选基因的筛选分析等,以期为揭示黄皮西葫芦的分子标记辅助育种奠定基础。所获得的结果如下:(1)西葫芦黄皮和绿皮性状的遗传规律分析。以西葫芦黄皮(19pu11)和绿皮(19pu07)高代自交系为亲本进行杂交分别获得F1代,进一步自交获得F2代分离群体;同时用绿皮亲本对F1代回交获得BC1代群体。通过运用色差仪对双亲及其后代果皮表型进行鉴定,结果表明色差指数a值和CCI值可以显著区分西葫芦果皮的黄色和绿色。其中,绿皮的果皮色差指数a值和CCI值为负值,而黄皮和F1的果皮色差指数a值和CCI值均为正值,且随着果实发育从子房期到商品期逐渐增加。遗传统计分析发现:黄皮绿皮杂交F1代果实子房期均为黄皮,F2代群体发生性状分离,且黄皮与绿皮的分离比为3:1,(?)(17)值=2.398<(?)(17)(15)(13)(15)(20)(28)3.84;BC1代群体黄皮与绿皮的分离比为1:1,(?)(17)值=0.007<(?)(17)(15)(13)(15)(20)(28)3.84,说明西葫芦黄皮、绿皮性状由一对等位基因所控制,且黄皮对绿皮为显性。(2)基于西葫芦基因组信息的黄皮基因的精细定位。首先利用F2代群体分别构建黄皮、绿皮两个混合池,再加2个亲本进行基因组重测序的BSA-seq分析,结果将控制西葫芦黄皮性状的基因初步定位在10号染色体上约2.75 Mb的区间内。进一步在此区间内开发并筛选出28对In Dels标记,通过1138株的F2代群体遗传分析,最近的2个In Dels标记Id 10和Id 11遗传距离分别为0.3 c M和3.6 c M,将候选基因定位到大约256kb的物理距离内,根据参考基因组的注释信息预测,该区域有23个基因,Cp4.1LG10g11560(CHLH)编码镁螯合酶H亚基,初步判断可能是决定西葫芦黄皮性状的候选基因。(3)西葫芦Cp4.1LG10g11560基因及其启动子的克隆分析。对黄皮和绿皮双亲基因组及其启动子区域克隆测序发现,黄皮启动子区域中有56 bp的序列插入,黄皮基因组DNA全长克隆测序中发现有55 bp的插入,编码区克隆测序发现均含有57 bp的内含子区域。在启动子和基因全长插入片段处设计In Dels分子标记,并在上述分离群体中验证,发现绿皮材料均为隐性条带,黄皮材料均为显性条带。在定量分析结果中,Cp4.1LG10g11560基因在绿皮材料中呈现先升后降的趋势,在黄皮材料中则为先降后升再降的表达趋势。综上所述,本研究通过遗传分析、标记筛选等将黄皮基因定位在10号染色体上256kb的区间内,并对黄皮候选基因Cp4.1LG10g11560进行了克隆比较,为下一步黄皮基因的最终确认奠定基础,也为黄皮西葫芦新种质的创制提供分子标记。
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