课题一人促血液血管细胞生成素(Hemangiopoietin,HAPO)对脐静脉内皮细胞的生物学作用和信号转导机制研究目的:人促血液血管细胞生成素(Hemangiopoietin,HAPO),是我们实验室从再生障碍性贫血病人尿中纯化出的一种蛋白质,基因序列比较发现它是一种新的细胞因子。HAPO基因的同源性分析(BLAST)结果表明,该因子是蛋白多糖4基因的一种新的剪接体。功能研究发现,HAPO在体外能明显刺激人的造血及骨髓细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖,而且HAPO主要作用于人的造血和血管内皮干/祖细胞的早期阶段,是一种早期生长因子;HAPO还可以拮抗人巨核细胞白血病细胞系MO7e去除因子诱发的凋亡;体内研究发现HAPO有放射保护作用,能明显提高经同位素亚致死量照射小鼠存活率,加速其造血功能的恢复。为了能更加深入的了解HAPO的生物学功能,我们以HUVEC为实验模型,研究了HAPO促进细胞增殖所涉及的信号转导机制。方法:在本实验里,我们用MTT和BrdU掺入的方法检测了HAPO对于HUVEC增殖能力的影响,并用流氏检测了HUVEC细胞周期的分布。我们用Western blot的方法检测了HAPO对于HUVEC内不同信号转导通路的激活情况。信号转导常用阻断方法来进行分析。激酶抑制剂是一种小分子化合物,近年来出现的一些高特异性蛋白激酶抑制物能够专一高效地抑制特定蛋白激酶的功能。目前,在国内外研究信号转导机制的文献中,几乎绝大部分都采用了激酶抑制剂作为阻断分析研究的首选。该方法特异,简单,易于量化,重复性好,且对细胞影响较少。此外,我们对HAPO与其他作用比较明显的内皮细胞刺激因子的协同作用进行了检测。结果:HAPO能增加内皮细胞的增殖能力,并呈剂量依赖性。500 ng/ml HAPO的效果最为明显,可以达到130±5%(MTT)和142±6%(BrdU)。通过Westernblot分析,我们发现HAPO在HUVEC中激活了PI3-K/Akt信号通路,50μM的LY294002可以完全抑制HAPO造成的Akt的磷酸化。我们用抑制剂阻断的方法证明了HAPO是通过激活PI3-K/Akt信号通路来促进HUVEC增殖的。进一步的检测与分析发现HAPO可以明显的上调HUVEC中cyclin D1蛋白的表达。在协同作用分析中,HAPO可以明显的增加VEGF的促内皮增殖的能力,却没有能增加bFGF促内皮增殖的能力。结论:我们的研究表明HAPO具有促进内皮细胞增殖的生物学作用。HAPO通过激活内皮细胞中的PI3-K/Akt信号通路,进而上调cyclin D1蛋白的表达。这可能是HAPO促进内皮细胞增殖的信号转导机制之一。课题二ABCG2在肿瘤细胞增殖中的作用目的:ABCG2(ATP binding cassette superfamily G member 2)是ABC转运体家族的成员之一,最早被定义为多药物耐药转运蛋白,它首先在乳癌细胞中被发现,因此又称为breast cancer resistance protein(BCRP)。ABCG2的表达不仅局限于肿瘤细胞,事实上还表达于机体的多种正常组织中,人们推测ABCG2可能与这些器官的外排及分泌功能有关。到目前为止,ABCG2的功能研究还是不很全面的。众所周知,ABCG2是一个具有很强能力的转运蛋白,可以将多种底物泵出细胞外,诸如带电荷的疏水性大分子,有机阴离子,硫酸盐化合物等等。因此,我们推测ABCG2可能通过外排一些生理底物或者机体代谢物,来参与包括细胞增殖在内的多种生物学活动。方法:在本实验里,我们选取了三个细胞系作为研究对象。MCF-7/MX是一株耐米托蒽醌的多药耐药人类乳腺癌细胞系,该细胞系高表达ABCG2。A549是一株人肺腺癌细胞系,表达较低水平的ABCG2。我们没有检测到DU145细胞系中有ABCG2的表达,因此将其作为阴性对照细胞系进行研究,以提高我们所得到的实验数据的可信性。我们采用RNA干扰和ABCG2特异性抑制剂两种方法抑制ABCG2的功能。然后,用MTT和BrdU掺入的方法检测了三个细胞系增殖能力的改变,并用流氏检测了细胞周期的分布,用BrdU掺入的方法确定了S期细胞的比例。此外,我们还用Western blot的方法检测了参与细胞周期调控的重要蛋白的表达水平。结果:通过Western blot分析,我们发现ABCG2特异性siRNA有效的降低了MCF-7/MX和A549两个细胞系中ABCG2蛋白的表达并且明显抑制了ABCG2的功能。ABCG2特异性siRNA明显地抑制了MCF-7/MX和A549两个细胞系的增殖,却对DU145没有作用。在干扰后的第二天,MCF-7/MX和A549的周期分布出现了明显的G0/G1期抑制。此外,我们还发现ABCG2特异性siRNA明显的减少了MCF-7/MX和A549的S期细胞。通过对参与细胞周期G0/G1至S期的调控蛋白进行的分析,我们发现ABCG2特异性siRNA明显的降低了MCF-7/MX和A549两个细胞系中cyclin D3蛋白的表达,同时增加了p21Cip1蛋白的表达。为了验证ABCG2的确参与了肿瘤细胞的增殖过程,我们选用了ABCG2的特异性功能抑制剂FTC,来进一步研究ABCG2对肿瘤细胞增殖的影响。实验结果表明,低剂量的FTC可以通过阻断ABCG2的泵功能来抑制细胞增殖,70μM的FTC抑制了A549和MCF-7/MX的增殖却对DU145没有影响。周期分析表明,该剂量的FTC增加了A549和MCF-7/MX的G0/G1期的细胞数目,减少了S期的细胞。结论:我们的研究表明ABCG2的确参与了肿瘤细胞的增殖过程。通过特异性沉默或者抑制剂作用,肿瘤细胞出现了G0/G1期的周期阻滞,减少了进入S期的细胞数目。这一现象与cyclin D3表达的下调和p21 Cip1表达的上调相关。进一步对相关生理底物的研究,以及对ABCG2所涉及的周期调控的多种信号通路之间的研究将为更好的理解ABCG2在细胞增殖过程中的重要作用提供重要依据。