茶树CsPAL3基因克隆及其功能分析

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:sksliuxin6
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紫化茶树是一种特色的优异茶树种质资源,因其富含花青素、色彩独特且保健性强而备受关注。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。本研究以高花青素紫化茶树武夷奇种C18为试验材料,主要研究结果阐述如下:(1)以紫化茶树武夷奇种C18茶树为材料,采用RACE技术克隆获得CsPAL基因的cDNA全长序列,命名为CsPAL3(登录号为KY865305.1),分析其生物信息学特征。参考NCBI上已登录的CsPALa(登录号为 KY615669.1)、CsPALb(登录号为 KY615673.1)、CsPALc(登录号为 KY615671.1)、CsPALd(登录号为 KY615674.1)、CsPALf(登录号为KY615670.1)等基因序列,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测不同叶色茶树品种(系)中的花青素总量以及CsPALs基因家族成员的表达情况。结果表明,茶树CsPAL3基因的cDNA全长为2518bp,包含一个完整的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),大小为2130bp,编码709个氨基酸。该序列分析表明,茶树CsPAL3基因编码的蛋白质为稳定亲水性蛋白,预测分子量为77.40kD,理论等电点为6.26;Blast分析序列发现茶树CsPAL3基因与芒果MiPAL基因的相似性最高,为87%。而在同源进化树分析中,显示为茶树CsPAL3蛋白与芍药PiPAL蛋白的亲缘关系较近。在比较不同叶色茶树品种(系)的差异中,结果表明紫化茶树的花青素总量和 CsPALa、CsPALb、CsPALc、CsPALd、CsPAL3(CsPALe)基因的相对表达量均高于常规绿叶茶树和白化茶树。这表明茶树CsPALa、CsPALb、CsPALc、CsPALd、CsPAL3(CsPALe)基因上调表达可能促进茶树花青素合成积累,使得茶树叶片呈现紫色。(2)通过染色体步移法克隆获得紫化茶树武夷奇种C18的CsPAL3基因启动子即5’端侧翼序列,采用软件Plant CARE在线分析该序列的顺式作用元件。结果表明,该启动子序列中除CAAT-box和TATA-box核心启动子元件之外,还包含光响应(G-box、I-box、Sp1等)、脱落酸响应(ABRE)、低温响应(TCA-element)、干旱胁迫响应(MBS)、茉莉酸甲酯响应(CGTCA-motif、TGACG-motif等)、热激响应(HSE)等环境胁迫相关的顺式作用元件。选取生长形势一致的茶树植株的第2叶位叶片,采用锡箔纸对其遮阴一半,另一半以自然光照条件为对照,分别经过2d、4d、6d、8d、10d的遮阴处理。检测花青素总量、茶树CsPALs基因家族成员的相对表达量在遮阴组和光照组的的差异情况,结果表明,随着时间的增加,茶树CsPALs基因家族成员的相对表达量在遮阴组和光照组中均呈现下调趋势,并且,遮阴组的相对表达量下降趋势显著大于光照组,表明茶树CsPALs基因家族成员的相对表达量受光照调控。其中CsPALa在遮阴处理4d的相对表达量降低最明显,CsPALb在遮阴处理6d的相对表达量降低最明显,CsPALc在遮阴处理4d的相对表达量降低最明显,CsPALd在遮阴处理2d的相对表达量降低最明显,CsPAL3在遮阴处理2d的相对表达量降低最明显,CsPALf在遮阴处理8d的相对表达量降低最明显。在遮阴处理8d后,花青素含量在光照组和遮阴组均下降且无明显差异,这与CsPAL3基因的相对表达量变化一致,可以推测CsPAL3基因可能调控茶树花青素合成和积累。(3)应用Gateway技术体系分别构建了茶树CsPAL3过表达载体pGWB502:CsPAL3和pGWB505:CsPAL3,并成功将其转入农杆菌GV3101。通过注射烟草进行瞬时表达,借助激光共聚焦扫描显微镜可观察到GFP绿色荧光,说明成功瞬时表达,CsPAL3主要定位在细胞核和细胞膜中。通过侵染拟南芥,筛选纯合子,获得稳定表达的CsPAL3转基因拟南芥。对比野生型拟南芥和CsPAL3转基因拟南芥的花青素含量,发现并无明显差异,推测CsPAL3异源表达可能无法合成花青素或者是由于单个CsPAL3酶基因无法合成花青素。通过RT-qPCR技术检测CsPAL3在CsPAL3转基因拟南芥根部的相对表达量显著高于叶片,并且在遮阴组的相对表达量比光照组的下降趋势更明显,说明CsPAL3是受光照调控的,这与茶树上的研究结果一致。
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