论文部分内容阅读
神经嵴干细胞(Neural crest stem cells, NCSCs)是一种多潜能神经干细胞,具有分化为多种细胞类型的能力,包括血管平滑肌细胞(Smooth muscle cells, SMCs)、成骨细胞、软骨细胞、成脂细胞、施旺细胞和神经元等。因此,NCSCs被认为是构建组织工程化血管支架潜在的种子细胞来源。然而,血管微环境,尤其血管壁受到的力学刺激,如何影响NCSCs的分子机理,至今尚未所知。天然血管在机体内一直受到体内搏动性动脉血流所产生的力学刺激,即血流脉冲对血管壁施加的周期性单轴拉伸应力,它在NCSCs分化成血管SMCs的过程中起着重要的作用。为模拟血管壁上SMCs沿圆周方向排列分布,我们引入软光刻技术(Soft lithography)制备表面具有平行排列微沟的弹性硅胶膜,这种微排列可使NCSCs和受力方向平行,同时选用来源于人体胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)和诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)的NCSCs作为模式细胞,通过自制的机械拉伸装置对细胞施加5%、1Hz的周期性单轴拉伸的牵引力,考察NCSCs对机械拉伸的各向异性响应;在此基础上,结合化学因子,深入探讨平行于微沟方向的机械拉伸调节NCSCs向SMCs分化的研究。本研究设定三个实验组:在光滑弹性膜上受力的称为平板组(Unpatterned),受力方向与微沟平行的称为平行组(Parallel-patterned)、受力方向与微沟垂直的称为垂直组(Perpendicular-patterned),我们分别从细胞形态、细胞增殖、分子水平和蛋白水平等方面进行检测。主要研究工作和结果如下:1. NCSCs对机械拉伸的各向异性响应初探:NCSCs具有多潜能性,且在发育和组织再生过程中起着极其重要的作用。然而,NCSCs对力学刺激的各向异性响应仍不清楚。为了研究这一各向异性力学响应,我们将NCSCs培养在表面具有平行排列微沟的弹性膜上,然后对其施加5%、1Hz的周期性单轴拉伸1-2天,受力方向与微沟平行/垂直。共聚焦显微镜结果显示,三个实验组中,平板组的细胞垂直于受力方向排列,平行组和垂直组的细胞沿着微沟方向有序排列;细胞与细胞核的形态随之做出相应的变化;机械拉伸使平行组的细胞增殖率和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性显著增加;机械拉伸使平板组与平行组这两组的收缩性标记蛋白Calponin 1 (CNN1)表达明显上调,同时使平行组的SMCs中期标记Smoothelin (SMTN)表达增强,但不引起其它标记的变化。这些结果显示,NCSCs对各向异性的力学微环境有着不同的响应,且平行组即受力方向与微沟平行的NCSCs更好地模拟血管微环境,且具有向SMCs分化的趋势。2.平行于受力方向的机械拉伸调节NCSCs向SMCs分化的研究:为了探讨血管内的力学因素是否对NCSCs向SMCs分化起到调节作用,我们特别关注平行组的机械拉伸,即细胞受力方向与微沟平行,以模拟血管SMCs圆周方向的排列与受力。结果显示,首先,平行于微沟方向的机械拉伸改变了细胞形态,增强了NCSCs的增殖能力和ERK2的磷酸化;此外,短期的机械拉伸诱导了收缩性标记蛋白CNN1和SMCs中期标记SMTN增加,机械拉伸长期作用使SMCs后期标记Myosin heavy chain (MHC)轻微增强。同时,该机械拉伸抑制了其他分化标记的表达,说明平行于微沟方向的机械拉伸促使NCSCs向SMCs分化。在拉伸过程中,神经基础培养基会抑制CNN1的表达,TGF-β1反而会促进这一表达。若先用TGF-β1处理NCSCs,再进行机械拉伸,会诱导CNN1和MHC表达显著增加。这些结果显示机械拉伸对NCSCs分化的调节主要依赖于化学因子和NCSCs的分化时期。理解力学因素对NCSCs分化的调节,显示出力学微环境在NCSCs发育过程中分化的作用,将为血管组织的重建提供有力的线索,为NCSCs应用于组织工程提供了良好的理论依据。