我国是世界第一的猪肉生产国和消费国。饲用抗生(菌)素的大量使用在促进畜产品增长的同时,也带来了严重隐患,耐药微生物及其耐药基因通过猪肉产业链的传播,给公众健康带来危害。磺胺类药物是使用量最大的兽用抗菌药之一,被广泛应用于畜禽细菌感染性疾病的防治,其耐药微生物及耐药基因(sul1、sul2和sul3)是猪肉产业链中耐药基因的主要来源之一。大肠杆菌作为耐药基因的供体、受体和中间载体,是抗生(菌)素耐药基因传播的重要媒介和潜在来源库。生猪屠宰厂是猪肉产业链最重要的中间环节之一。因此,本课题以生猪屠宰厂大肠杆菌为研究对象,探究其携带的磺胺耐药基因在猪肉生产及环境中的分布特征、传播及在大肠杆菌中的适应性代价和可能存在的适应性机制,为控制细菌耐药基因通过猪肉产业链的传播与扩散提供理论基础和支撑。主要研究内容和结果如下:1.生猪屠宰厂大肠杆菌磺胺耐药基因的分布特征和磺胺耐药菌株的亲缘关系:建立了可视化高效同步检测磺胺耐药基因sul1、sul2和sul3的RPA-LFD方法。通过该方法探明了生猪屠宰厂大肠杆菌磺胺耐药基因sul1、sul2和sul3的分布特征:磺胺耐药基因总检出率为70.2%,其中sul1 为 18.86%,sul2 为 22.29%,sul3 为 3.43%,各个采样点的大肠杆菌sull和sul2基因携带率互有高低,但都显著高于sul3基因(p<0.05)。复合磺胺耐药基因携带率为25.71%,其中sul1+sul2 为 20.00%,sul1+sul3为1.71%,sul2+sul3为 3.14%,sul1+sul2+sul为0.86%,sul1+sul2组合的携带率在各个采样点都显著高于其它组合方式(p<0.05)。之后,利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分析(MLST)分子分型技术,分析了 34株包含不同来源全部7种磺胺耐药基因排列组合的代表性大肠杆菌间的亲缘关系,结果成功将其分为29个脉冲型和25个ST型。34株大肠杆菌谱型分散,同一克隆型菌株数少,且同一克隆型的菌株携带的磺胺耐药基因型不尽相同,表明34株大肠杆菌整体亲缘性较远,其携带的磺胺耐药基因存在少量随细菌的垂直传播,但可能主要以水平基因转移(horizonta1 gene transfer,HGT)的方式进行水平传播。2.生猪屠宰厂大肠杆菌磺胺耐药基因经HGT介导的水平传播:通过Southern杂交对17株携带复合型磺胺耐药基因的大肠杆菌sul1、sul2和sul3基因进行定位,9株的磺胺耐药基因全部位于质粒,4株全部位于基因组,另有4株同时位于质粒和基因组上。13株大肠杆菌其携带磺胺耐药基因的质粒均可通过接合转移和质粒转化获得接合子和转化子。接合子和转化子质粒分型结果一致,且13株中有11株的质粒属于IncF/IncK多复制子质粒。采用PCR walking法对13株质粒结合子和转化子进行侧翼序列和遗传环境分析,9个sul1基因有7个位于两个IS6插入序列之间;11个sul2基因有11个与链霉素耐药基因strA和strB相邻,7个sul2基因位于转座子序列tnpA和tnpB或插入序列IS6和IS5之间;9个sul3基因有6个位于插入序列IS6和IS256之间。另对8株大肠杆菌位于基因组上的磺胺耐药基因进行侧翼序列和遗传环境分析,其中5个sull基因均位于1型整合子上;7个sul2基因均位于IS6和IS91插入序列之间;2个sul3基因均没有与可移动元件相邻。以上结果表明生猪屠宰厂大肠杆菌磺胺耐药基因经HGT介导的水平传播有:(1)通过IncF/IncK多复制子质粒介导进行水平传播;(2)质粒上sul1、sul2和sul3主要通过插入序列(IS6、IS5、IS256和IS26)、转座子序列(tnp4和tnpB)和1型整合子等可移动遗传元件介导进行水平传播;sul2基因还可在链霉素共选择作用下进行水平传播;(3)基因组上的sul1基因主要通过1型整合子进行水平传播;sul2基因主要通过插入序列IS6和IS91进行水平传播;sul3基因侧翼序列无可移动遗传元件,水平传播潜力小。3.sul3基因与sul1和sul2基因在大肠杆菌中的适应性差异:为了研究sul1、sul2和sul3基因在大肠杆菌中的适应性,本课题构建了遗传背景一致的分别携带sul1、sul2和sul3基因的工程菌株。对菌株分别进行两两体外竞争试验,发现在营养充足、无药物选择压力、无其他影响因素条件下,菌株E.coli BL21:pET23a-sul3的适应性代价选择系数S为-0.087±0.020,S<0,表现为有适应性代价;菌株五.coli BL21:pET23a-sul1 和E.coli BL21:pET23a-sul2 的适应性代价选择系数S分别为0.021±0.012和0.019±0.016,S>0,在竞争试验中适应性良好。此外,菌株E.coli BL21:pET23a-sul3的生长能力、质粒稳定性和运动能力都显著低于其它2株菌(p<0.05)。进而利用Label-free定量蛋白组学和Real-time PCR定量技术在蛋白水平和转录水平上探索磺胺耐药基因表达时大肠杆菌适应性变化的机制,结果显示E.col BL21:pET23a-sul3的适应性代价显著大于其它2株菌的主要原因有:1)细菌运动性相关蛋白FliZ、FliA、FliC和LrhA的差异表达影响了E.col BL21:pET23a-sul3的运动性;2)外膜孔道蛋白OmpD和ABC转运系统中ATP结合蛋白UgpC、RbsA、GsiA的差异表达影响了E.col BL21:pET23a-sul3的能量代谢;3)二氢蝶酸合成酶SUL3表达量较SUL1和SUL2显著降低(p<0.05),导致其叶酸合成调控能力下降,影响了E.col BL21:pET23a-sul3的繁殖能力。综上所述,生猪屠宰厂不同来源大肠杆菌sull和sul2基因的携带率显著高于sul3基因(p<0.05)。质粒上sull、sul2和sul3基因主要是通过IncF/IncK多复制子质粒介导以及插入序列(IS6、IS5、IS256和IS26)、转座子序列(tnpA和tnpB)和1型整合子序列等可移动遗传元件介导的水平传播。基因组上sull和sul2基因主要是1型整合子和插入序列IS6和IS91介导的水平传播。位于基因组上的sul3基因侧翼序列缺乏可移动遗传元件,因而水平传播潜力小。sul3基因与sul1和sul2基因在遗传环境和适应性上的差异是sul3基因在生猪屠宰厂大肠杆菌中的携带率显著低于sull和sul2基因的主要原因之一。本研究结果加深了对生猪屠宰厂磺胺耐药基因传播的认识,为寻找控制磺胺耐药基因随猪肉产业链传播的方法提供了理论基础。