论文部分内容阅读
玉米是世界主要粮食作物之一,其籽粒中的储藏淀粉是玉米的主要利用产物。基于玉米淀粉的产量和品质,其被广泛用作畜禽饲料和工业原料,同时在能源、化工等领域也具有重要的应用前景。在土地资源匮乏和能源危机的当下,玉米淀粉对于解决世界粮食危机和能源危机具有一定的作用。玉米籽粒中的淀粉生物合成主利用运输至造粉体中的光合作用直接产物蔗糖,其合成的过程主要包括:ADPG的生物合成与转运、多聚糖链的延伸、多聚糖链的分支与去分支以及淀粉粒的形成等;其合成过程中主要功能蛋白有腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(Starch synthase)、淀粉分支酶(Branching enzyme)、淀粉去分支酶(Debranching enzyme)、淀粉磷酸化酶(Starch phosphorylase)以及ADPG转运蛋白(Transporter BT1)。基于不同物种的研究表明,转录调控是淀粉生物合成过程中重要的调控方式,它主要依赖于顺式作用元件(cis-element)和反式作用因子(trans-acting factor),共同调节基因的转录水平,影响淀粉的生物合成。目前在玉米籽粒储藏淀粉的生物合成过程中,基因的转录调控机制研究较少。因此,鉴定参与玉米籽粒淀粉合成调控的顺式作用元件和反式作用因子,不仅有利于完善玉米籽粒淀粉生物合成的调控途径,同时也能为玉米分子育种中提高产量、改善品质提供新的基因资源。本研究以玉米自交系18-599(红)为试验材料,测定淀粉在胚乳发育中的动态积累,分析淀粉合成相关基因的表达模式;结合基因组序列,预测不同物种中淀粉合成相关酶基因启动子的顺式作用元件;利用胚乳瞬时转化体系鉴定ZmBT1基因启动子活性位点;结合ZmBT1基因启动子活性位点、基因表达模式以及共表达分析等方式筛选得到候选基因ZmMYB14与ZmNAC126。通过RT-PCR等技术分析基因的表达模式。利用不同的受体系统研究ZmMYB14与ZmNAC126的功能特性以及二者参与玉米淀粉合成的转录调控机制。主要结论如下:1.对玉米自交系18-599的淀粉测定与基因表达模式分析结果表明,授粉10d以后,淀粉在胚乳中开始大量积累,淀粉积累的趋势与胚乳中的淀粉合成相关酶基因表达模式相联系。不同物种的淀粉合成相关酶基因启动子的顺式作用元件预测表明,淀粉合成相关酶基因启动子中存在响应植物激素、光信号、逆境信号以及调控基因表达的顺式作用元件。2.通过利用胚乳瞬时转化体系以及β-glucuronidase和Luciferase报告基因系统对玉米自交系18-599(红)中克隆得到的ZmBT1基因1644bp的启动子片段进行片段缺失、突变位点的活性分析。首次鉴定得到ZmBT1基因启动子中-280bp到-151bp片段以及-151bp到+14bp片段能极显著影响启动子活性;首次发现-280bp到-151bp片段中的MBSI位点是影响ZmBT1基因启动子活性的重要顺式作用元件。3.基于基因表达模式、MBSI位点以及对启动活性的影响筛选得到ZmMYB14。结合分子生物实验技术分析发现,ZmMYB14是一个定位细胞核中,具有转录激活活性且转录激活位点位于C端的2R-MYB转录因子;ZmMYB14在玉米胚乳中高表达且受外源ABA和蔗糖处理的诱导;通过胚乳瞬时转化体系以及酵母单杂交分析表明,ZmMYB14能与-280bp到-151bp发生结合作用,且通过MBSI位点极显著的促进pZmBT1启动子活性,但结合作用不直接受到MBSI的突变和缺失的影响。由此表明,ZmMYB14参与ZmBT1基因的转录调控。4.通过基因枪瞬时转化、酵母单杂交以及水稻中花11外源表达ZmMYB14基因对ZmMYB14参与玉米淀粉合成过程的转录调控机制进行研究。结果发现ZmMYB14能通过直接与淀粉合成相关酶基因启动子pZmGBSSI、pZmSSI以及pZmSBE1相结合,并促进启动子的活性;对于pZmSh2、pZmBt2启动子的活性影响则是依赖于间接作用。同时ZmMYB14能直接结合pZmSSIIa、pZmISA1和pZmISA2启动子,但对启动子活性没有明显作用。在对外源表达ZmMYB14基因的T1代水稻的外源表达株系、阴性株系以及野生型的淀粉合成相关酶基因的转录水平检测发现,外源表达ZmMYB14能提高水稻ADPG转运蛋白编码基因OsBT1、淀粉合成相关酶基因OsAGPL2、OsSBEI、OsGBSSI、OsISA1、OsSSIIa、OsSBE2b以及OsPul基因的转录水平。由此表明ZmMYB14能参与玉米淀粉生物合成过程中基因的转录调控,且能同时调控多个基因的转录。5.通过共表达以及对pZmBT1启动子活性作用的分析筛选得到ZmNAC126基因,结合分子生物实验技术研究其在玉米淀粉生物合成过程中的调控机制。结果发现,克隆得到的ZmNAC126基因编码一个含有NAM保守结构域,定位在细胞核中,转录激活结构域位于C端的NAC家族转录因子;ZmNAC126在玉米籽粒与胚乳中高表达,与玉米淀粉合成相关酶基因存在共表达现象;且能与CACG核心基序的重复序列相结合。基于酵母单杂交与胚乳瞬时转化实验分析表明,ZmNAC126能通过与pZmGBSSI以及pZmBT1启动子直接作用促进启动子活性,通过与pZmISA1以及pZmISA2启动子直接结合抑制启动子活性,通过间接作用促进启动子pZmSh2、pZmBt2以及pZmSSIIIa活性,对于淀粉合酶ZmSSI基因启动子pZmSSI以及淀粉分支酶ZmSBEI基因启动子pZmSBE1的活性没有明显的影响。由此表明,ZmNAC126参与玉米淀粉合成相关酶基因的转录调控,且能以不同的方式作用于多个基因的调控过程。