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在众多的压力蛋白家族中,小分子热休克蛋白(sHSPs)根据其结构和功能可以分为许多种类,显示了细胞伴侣的功能并且能够帮助非正常折叠的蛋白维持其正确的状态。sHSPs可参与很多生理学过程并且在面对众多外界压力时起重要作用。本文以中华稻蝗( Oxya chinensis)为实验材料,研究了中华稻蝗小分子热休克蛋白(OcsHSPs)基因的分子特性及环境污染物镉对其基因表达的影响,以期为深入研究OcsHSPs的功能提供基础资料。 一、本论文从中华稻蝗(Oxya chinensis)转录组数据库搜索获得6个sHSPs的核苷酸序列。使用特异性引物验证了这6个OcsHSPs基因序列的全长并根据其分子量大小分别命名为:OcHSP19.1、19.8、20.4、20.7、21.1和23.8。这6个OcsHSPs的氨基酸序列都有一个包含大约100个氨基酸残基的典型的α晶体蛋白结构域和5个β折叠区。系统进化分析表明OcHSP23.8是直系同源蛋白,分别和其他昆虫的1个sHSP聚为一族,OcHSP19.1、20.4、20.7和21.1是物种特异性蛋白而聚为一族,然而 OcHSP19.8并没有聚到直翅目那一族而是处于聚类树的最下端。中华稻蝗OcsHSPs基因的克隆及序列分析为之后对其基因表达模式和功能的研究奠定了基础。 二、使用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测了这6个OcsHSPs基因在中华稻蝗体内的表达情况。发现其在不同发育阶段都有一定表达。其表达存在明显的组织特异性,OcHSP19.1、20.4、20.7和21.1基因在精巢和/或卵巢出现最高表达量, OcHSP19.8和23.8基因在肌肉的表达量最高。这些sHSPs基因在特定组织的表达可能在维持细胞和组织的特定功能上起重要作用。精巢和卵巢是昆虫主要的生殖器官,这一结果表明OcsHSPs可能参与昆虫的生殖和发育。结果表明这6个OcsHSPs基因在所有发育阶段都有表达,说明OcsHSPs基因在中华稻蝗新陈代谢过程中起重要作用。中华稻蝗OcsHSPs基因的组织和发育表达特性将有助于进一步研究其功能。 三、sHSPs能够被环境胁迫诱导,本文首先使用实时荧光定量PCR技术分析不同温度处理后6个 OcsHSPs基因在中华稻蝗的表达。结果表明 OcHSP19.1、OcHSP19.8、OcHSP20.4和OcHSP20.7的表达水平在27、32和37℃的不同处理时间没有明显变化,但其表达量都在42℃出现明显升高,尤其是在42℃处理后2 h表达量明显升高。OcHSP21.1和OcHSP23.8的表达水平在不同温度处理后并无明显变化。中华稻蝗热休克蛋白基因OcHSP19.1、OcHSP19.8、OcHSP20.4和OcHSP20.7基因都在高温处理后出现显著高表达,可能与昆虫机体的自我保护机制有关,在高温时机体迅速合成大量热休克蛋白以保护机体不被高温伤害。上述结果显示这6个OcsHSPs基因对温度变化具有不同的应答反应。 四、采用不同浓度氯化镉(CdCl2)溶液对中华稻蝗5龄若虫进行急性染毒,利用实时荧光定量PCR技术对6个OcsHSPs基因在整虫、精巢和卵巢的表达进行分析。结果表明在 Cd2+压力下这6个基因在中华稻蝗整虫出现了不同的表达模式:OcHSP19.1、19.8、20.4和20.7基因在0.48μg/μL Cd2+处理24 h出现高表达;OcHSP23.8基因的表达量在0.48μg/μL Cd2+处理6 h出现显著的升高;OcHSP21.1基因最高的表达水平出现在0.16μg/μL Cd2+处理24 h,0.32μg/μL Cd2+处理36 h,以及0.48μg/μL Cd2+处理12 h。结果表明,在精巢内,OcHSP19.1和OcHSP19.8基因经0.48μg/μL Cd2+处理,二者表达量都先降低之后显著升高,在36 h表达量最高。在卵巢内,OcHSP19.1和OcHSP21.1基因经0.32μg/μL Cd2+处理,二者都在36 h表达量最高;经0.32μg/μL Cd2+处理,OcHSP20.7基因的表达水平随着时间的延长出现先升高后降低的趋势。在精巢内OcHSP21.1基因和在卵巢内OcHSP20.4基因的表达水平与对照组相比无显著差异。研究结果显示,镉急性诱导中华稻蝗5个OcsHSPs基因在精巢和卵巢的表达模式不同,其表达量与镉浓度和作用时间相关。这6个基因在Cd2+处理后的不同表达模式预示着这些基因可能存在不同的功能。 综上所述,本研究克隆得到中华稻蝗6个全长OcsHSPs序列,分析了其二级结构,与昆虫已知sHSPs氨基酸序列进行比对,构建了系统进化树。利用实时定量PCR技术检测其在中华稻蝗不同龄期和不同组织部位的表达模式,之后研究温度和急性镉对这6个OcsHSPs基因表达的影响。综上所述,本文系统性的对中华稻蝗小分子热休克蛋白在基因水平做了相关研究,为sHSPs的分类以及进一步研究其生理生化功能提供基础资料,以期为OcsHSPs作为镉急性污染的分子标记奠定理论基础。