研究背景与目的:头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)作为人类最常见的六种癌症之一,70%以上的患者伴有复发或者转移,是目前严重影响人类生存健康的上皮来源恶性肿瘤。因此,寻找有效的治疗方案来治疗HNSCC成为当前的迫切需要。miRNA是一类内生性单链非编码小RNA,长度为20-24个核苷酸,通过结合到mRNA来调节蛋白编码,存在于动植物当中,广泛参与转录后基因的表达和调控,如细胞分化、增殖、凋亡和细胞周期调节等。目前,只有少数miRNAs的生物学功能被阐明,这些miRNAs被证实广泛地参与生命过程中的各种生理和病理过程。miRNA-141是miRNA-200家族中的一个,位于12p13.31,是一个成熟的序列,全长共22nt。近期研究发现miRNA-141可作为癌基因或者抑癌基因,通过调节不同的信号传导通路,在多种癌症中异常表达,例如胃癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、膀胱癌和卵巢癌,参与恶性肿瘤的增殖、分化、迁移,影响患者的预后。目前,miRNA-141在头颈鳞癌发生发展中的作用机制尚无明确报道。EGFR即表皮生长因子受体,是一种广泛分布的细胞表面受体。EGFR是ErbB保守的受体家族成员之一,具有络氨酸激酶活性,在细胞生长、转移和分化的生理过程中起重要作用。EGFR可启动核内相关基因,促进细胞的分裂与增殖。目前已知在头颈部鳞癌、肺癌、乳腺癌、胃癌和膀胱癌中EGFR表达均增高。目前尚未有miR-141与EGFR之间关系的报道。CDK4即细胞周期蛋白依赖性激酶4,其正常表达在细胞周期有序进行的过程中非常重要。目前已知CDK4在多种癌症中高表达,促进癌细胞的增殖,是一种癌基因。Bcl-2是一种已知的凋亡抑制基因,其产物bcl-2蛋白可以抑制多种恶性肿瘤的凋亡过程,延长肿瘤细胞的生长周期。MMP2能够降解多型胶原蛋白、结合蛋白及弹力蛋白,参与降解基底膜胶原与细胞外基质,促进癌细胞侵入破坏的细胞间连接结构,向周围组织浸润和迁移。在本研究中,我们将分析miR-141在头颈鳞状细胞癌中的表达及其在疾病的临床分期及预后的关系。此外,我们将分别在头颈鳞癌细胞FaDu和Cal-27中过表达或者抑制miR-141。通过体外细胞功能实验及动物实验来检测miR-141对EGFR、CDK4、bcl-2和MMP2表达的影响,探讨miR-141在头颈鳞状细胞癌中的作用。初步阐明miR-141表达在头颈鳞癌中的作用和意义,为HNSCC的诊疗提供新的治疗靶点提供参考依据。研究方法:采用实时荧光定量的方法,检测miR-141在头颈鳞癌组织和癌旁正常组织中的表达情况;通过生物信息学软件MiRDB预测miR-141的靶基因EGFR,采用荧光素酶实验验证miR-141和EGFR的关系,并采用实时荧光定量的方法,检测EGFR在头颈鳞癌组织和癌旁正常组织中的表达情况;采用Western blot在INOK、FaDu和Cal-27细胞中检测EGFR蛋白的表达,并用实时荧光定量PCR检测各组细胞中miR-141和EGFR的表达;用miR-141 mimics和miR-141inhibitor片段分别转染头颈鳞癌FaDu和Cal-27细胞。转染后,采用Western blot在各组细胞中检测EGFR蛋白的表达,并采用实时荧光定量PCR检测miR-141和EGFR在各组中的表达;然后通过MTT实验观察miR-141对FaDu和Cal-27细胞增殖的调节作用,采用Western blot和实时荧光定量PCR检测CDK4的表达情况。通过JC-1测定实验,观察miR-141对FaDu和Cal-27细胞凋亡的影响,Western blot和实时荧光定量PCR检测miR-141对bcl-2的影响。通过transwell实验检测miR-141对FaDu和Cal-27细胞的迁移能力的影响,采用Western blot和实时荧光定量PCR检测miR-141对MMP2的表达的调节作用。构建裸鼠头颈鳞癌肝转移模型,尾静脉注入miR-141过表达的FaDu和对照FaDu细胞,通过HE染色观察头颈鳞癌细胞的肝定植情况,并采用Western blot和实时荧光定量PCR检测EGFR、CDK4、bcl-2和MMP2的表达。结果:在我们收集的30对组织中分析miR-141的表达,发现HNSCC组织中miR-141表达相对低于邻近组织,并且它与HNSCC的发生和发展相关。同时发现EGFR在HNSCC组织中高表达。miR-141表达较高的患者存活时间长于miR-141表达较低的患者。在HNSCC中,miR-141与EGFR表达呈负相关。通过miRDB预测软件发现miR-141可以与EGFR的3’-UTR组合。荧光素酶测定显示,当FaDu和Cal-27细胞与EGFR和miR-141共转染时,荧光素酶活性受到抑制;当EGFR mut或miR-141反义物被转染到细胞中时,没有抑制消失。此外,在HNSCC细胞中存在更高的EGFR表达和更低的miR-141表达。当miR-141在细胞中过表达时,EGFR的表达降低,当miR-141受到抑制时,EGFR的表达升高。说明了EGFR是miR-141的直接靶标。MTT实验表明,miR-141的过表达抑制了HNSCC细胞的增殖。相反,当miR-141被抑制时,HNSCC细胞的增殖受到促进。研究还发现miR-141的过表达抑制了CDK4的表达,miR-141的下调促进了CDK4的表达。JC-1测定显示,与对照组相比,miR-141的转染可促进FaDu和Cal-27细胞的凋亡。Western blot和real-time PCR显示,这可能是由于miR-141对bcl-2的抑制引起的。Transwell测定显示,miR-141的转染抑制FaDu和Cal-27细胞的迁移和侵袭,相反,miR-141的抑制促进细胞转移。蛋白质印迹和实时PCR显示miR-141的过表达抑制了MMP2的表达,miR-141的下调促进了MMP2的表达。在动物实验中,miR-141高表达的头颈鳞癌细胞注射后的裸鼠肝转移明显减少,瘤体体积也较小。同时,采用Western blot和RT-PCR方法检测靶基因EGFR表达降低,EGFR调控的下游基因CDK4、bcl-2和MMP2表达也降低。结论:1、Has-miR-141在头颈鳞癌组织中的表达低于癌旁正常组织;EGFR在头颈鳞癌组织中的表达高于癌旁正常组织;两者呈负相关。2、Has-miR-141通过靶向结合作用调控EGFR发挥抑癌基因的作用。3、Has-miR-141可以抑制头颈鳞癌细胞的增殖和迁移,促进头颈鳞癌细胞的凋亡。4、Has-miR-141与EGFR、CDK4、bcl-2和MMP2呈负向关系,miR-141可能通过调控EGFR间接调控CDK4、bcl-2和MMP2,抑制头颈鳞癌细胞的增殖和迁移,促进头颈鳞癌细胞的凋亡。