论文部分内容阅读
目的:用MALT1激动剂PMA+Iono和MALT1抑制剂Z-VRPR-FMK刺激DLBCL和Burkitt淋巴瘤细胞,检查培养细胞的生长活力、凋亡和细胞周期变化,检查细胞内MALT1和A20蛋白。探讨PMA+Iono和Z-VRPR-FMK对两种淋巴瘤细胞生长的影响及其与MALT1和A20蛋白异常的关系,为发现侵袭性B细胞淋巴瘤治疗的新靶点提供可靠的实验依据。方法:培养DLBCL细胞株OCI-LY1,OCI-LY8和Burkitt淋巴瘤细胞株Raji,在培养细胞中加入MALT1激动剂PMA+Iono和特异性的抑制剂Z-VRPR-FMK;MTT法检查不同浓度、不同时间PMA+Iono和Z-VRPR-FMK处理的细胞代谢生长情况;利用蛋白印记检测MALT1和A20蛋白;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期变化情况。对检测结果进行统计学分析。结果:1.PMA+Iono和Z-VRPR-FMK对OCI-LY8细胞生长的影响:培养24h,当培养基中Iono浓度小于1μM时,加入10ng/ml,50ng/ml,100ng/ml浓度的PMA+Iono,OCI-ly8细胞生长与对照组无明显差异,P均大于0.05。Iono浓度等于1μM时,加入10ng/ml,50ng/ml,100ng/ml浓度的PMA+Iono时OCI-ly8细胞OD值(0.135±0.009、0.126±0.019、0.123±0.027)明显低于对照组(0.173±0.032),P均小于0.05。培养48h和72h,培养基中加入9种浓度的PMA+Iono(10ng/ml+125ng/ml、50ng/ml+125ng/ml、100ng/ml+125ng/ml、10ng/ml+0.5μΜ、50ng/ml+0.5μΜ、100ng/ml+0.5μΜ、10ng/ml+1μΜ、50ng/ml+0.5μΜ、100ng/ml+0.5μΜ),细胞OD值均低于0.200,明显低于相应对照组(48h:0.336±0.035,72h:0.805±0.079),P均小于0.05;相关分析发现:PMA浓度固定为10ng/ml、50ng/ml和100ng/ml时,培养48h和72h时Iono浓度与OCI-ly8细胞生长均成负相关关系,r和P依次为:48h:(-0.820,0.000)、(-0.782,0.001)和(-0.878,0.000);72h:(-0.800,0.000)、(-0.868,0.000)和(-0.919,0.000);加入25μΜ、50μΜ、75μΜ、100μΜ的Z-VRPR-FMK培养细胞24h、48h、72h,OCI-LY8细胞的OD值与相应对照组相比均无明显差异,P均大于0.05。2.PMA+Iono和Z-VRPR-FMK对OCI-LY1和Raji细胞MALT1和A20蛋白表达的影响:(1)OCI-LY1细胞:单独加入不同浓度(200ng/ml+0、200ng/ml+125ng/ml、200ng/ml+1μM、200ng/ml+2μM)的PMA+Iono作用2h和200ng/ml+1μM的PMA+Iono作用0.5h、2h、6h,OCI-LY1细胞内的MALT1蛋白表达与相应对照组之间没有明显差异,P均大于0.05。而不同浓度的PMA+Iono处理后A20蛋白相对表达量依次为2.44±0.77、3.09±0.74、4.35±0.74、5.01±1.06,后三组明显高于对照组,P值依次为0.118、0.021、0.001、0.000。不同作用时间的PMA+Iono处理后A20蛋白相对表达量依次为2.08±0.27、2.36±0.21、3.45±0.26,都明显高于对照组,P值依次为0.001、0.000、0.000。相关分析发现,细胞内A20蛋白表达与PMA+Iono作用的浓度和时间都有正相关关系,(r,P)分别为(0.911,0.000)和(0.959,0.000);加入不同浓度(25μM、50μM、75μM)的Z-VRPR-FMK和75μM的Z-VRPR-FMK作用0.25h、0.5h、2h,MALT1和A20蛋白表达与相应对照组之间未见统计学差异,P均大于0.05;同浓度同时间的PMA+Iono分别与不同浓度同时间的Z-VRPR-FMK和同浓度不同时间Z-VRPR-FMK处理细胞,MALT1和A20蛋白表达与相应对照组之间均无明显差异,P均大于0.05。(2)Raji细胞:单独、加入PMA+Iono及同时加入PMA+Iono和Z-VRPR-FMK,其MALT1蛋白与对照组之间没有统计学差异,P均大于0.05;上述处理后细胞内A20蛋白表达明显高于对照组。固定PMA+Iono浓度与时间处理细胞,细胞内A20蛋白表达随着加入Z-VRPR-FMK浓度的增加而增高,固定PMA+Iono浓度与时间及Z-VRPR-FMK浓度处理细胞,A20蛋白也随着Z-VRPR-FMK刺激时间的延长而表达增高,都有明显的浓度、时间的正相关关系,(r,p)分别为(0.928,0.000)和(0.937,0.000)。3.PMA+Iono和Z-VRPR-FMK对OCI-LY1细胞凋亡的影响:流式细胞术检测发现细胞培养中加入PMA+Iono处理48h细胞凋亡数(25.5±8.84)明显多于对照组(7.43±1.42),随着时间的延长,细胞凋亡率逐渐增加;加入Z-VRPR-FMK凋亡率在24h、48h、72h与相应对照组间均无明显差异。4.PMA+Iono和Z-VRPR-FMK对OCI-LY1细胞细胞周期的影响:加入PMA+Iono处理24h和48h,处于S期的OCI-LY1细胞百分率(依次为19.17±3.01、23.17±5.03)显著低于相应对照组细胞(36.26±8.54、33.50±5.10),P均小于0.05,处理72h则处于G2-M期的细胞百分率(7.05±1.75)明显高于对照组(2.65±0.83),P亦小于0.05。结论:1.PMA+Iono能够抑制DLBCL细胞的生长活力,其作用可能与细胞内A20蛋白的表达有关。2.Burkitt细胞内存在MALT1蛋白水解酶活性的增高,MALT1可能是Burkitt淋巴瘤治疗的新靶点。3.GCB样DLBCL细胞没有MALT1蛋白水解酶活性的增高,PMA+Iono则增加了细胞内A20蛋白的表达