背景与目的多粘菌素对大多数革兰阴性菌具有显著抑制作用,常用于治疗包括腹腔、尿道等在内的多部位感染,在上世纪曾被广泛使用。因其具有严重的肾毒性和神经毒性,且其他种类抗生素相对易于获得,在随后一段时间内,临床极少使用多粘菌素。碳青霉烯类药物具有较强的抗菌活性和广泛的抗菌谱,临床将其作为治疗革兰阴性感染的重要药物。但是,随着碳青霉烯类耐药菌株的不断涌现,多粘菌素重新受到重视,并作为临床抗感染治疗的又一重要手段。在20世纪90年代,多粘菌素多作为饲料添加剂,用于畜牧动物感染的预防和治疗。让我们担忧的是,随着多粘菌素在临床上的重新使用和畜牧业中的过度使用,多粘菌素耐药菌在全球范围内不断出现。随着2015年第一个可转移粘菌素耐药基因mcr-1的报道,至今已有十几种不同的mcr基因被发现,而其中最常见、分布最为广泛的是mcr-1基因。大量研究表明,人和动物（特别是家畜）是具有潜在致病性的多粘菌素耐药生物（COLROS）/携带mcr基因细菌（MGCB）的主要宿主。mcr在全球的迅速传播使得世界范围内抗感染治疗药物的选择空间非常有限,全球公共卫生受到严重的威胁。基于上述,针对多粘菌素耐药菌尤其是携带mcr基因的多粘菌素耐药菌的耐药机制、传播扩散的研究,是当前抗感染领域的热点。根据One Health策略,环境为“动物-环境-人”传播链的中心环节,在耐药传播中起到重要作用,而现有研究显示,牧场环境常常是多粘菌素耐药菌的一大分离来源,因此,我们对于牧场来源菌株进行了详尽的关注与探究。本课题收集2019年5月间嘉兴市6个牧场人源、动物源和环境源样本976份,对其增菌培养后初步筛选出多粘菌素耐药菌1116株,通过PCR筛选出携带mcr基因耐药菌;通过质谱、ANI分析和Kmerfinder鉴定分离菌株至种;通过S1-PFGE、Souther-blotting对其耐药基因进行定位;通过接合实验验证其耐药基因水平转移能力;通过体外药敏试验明确其耐药谱;通过二、三代测序技术结合生物信息学分析探究其ST分型、耐药基因携带情况、mcr-1基因环境、质粒特征及菌株间进化关系。本研究旨在为遏制多粘菌素耐药基因传播及为临床抗感染治疗提供实验室依据。方法1.采用含2mg/L多粘菌素的麦康凯平板从976份样本中分离筛选出1116株多粘菌素耐药菌株,通过PCR技术对mcr基因（mcr-1至mcr-10）进行初筛,通过质谱仪、ANI分析和Kmerfinder对菌株鉴定到种。2.采用微量肉汤稀释法和琼脂稀释法体外药敏试验测定菌株MIC值,明确其耐药谱。3.通过S1-PFGE和Southern-blot对耐药基因进行定位;通过接合实验验证其耐药基因水平传播能力。4.采用二、三代测序技术完成菌株全基因组序列分析,通过MLST service明确菌株ST分型。5.通过Resfinder、Plasmidfinder明确其携带耐药基因情况和质粒类型。6.通过PROKKA对测序结果进行注释,使用easyfig和BRIG呈现耐药基因基因环境和质粒比较图。7.通过Roary和MEGA X明确菌株间进化关系。结果1.2019年5月收集到的1116株多粘菌素耐药菌中共鉴定出96株mcr基因携带菌,其携带基因型均为mcr-1,且其中93株为大肠埃希菌,另外三株包括2株弗格森埃希菌和1株阿尔伯蒂埃希菌。2.药敏结果显示96株菌均对替加环素、美罗培南、氨曲南及阿米卡星敏感,且其中32株属于多重耐药菌。3.S1-PFGE和Southern-blot结果显示共有62株mcr-1基因定位于质粒,且其中42株具有水平转移能力。4.MLST结果显示共有27种ST分型,其中ST10为主要型别;Resfinder结果显示96株多粘菌素耐药菌均携带多种耐药基因,所有菌株均携带mcr-1,除两株弗格森埃希菌外,其他菌株皆携带大环内酯类耐药基因mdf（A）。5.根据三代测序结果,两株弗格森埃希菌的质粒类型分别为IncX4和IncI2,其中携带mcr-1的IncX4型质粒是首次在弗格森埃希菌中报道。6.mcr-1周围基因环境多样化,最常见基因序列为traL-mcr-1-ymoA-topB-yhcR-xerC,共有33株包含此序列。最常见的基因转移元件为ISApl1,在mcr-1的上游、下游或上下游皆存在。7.系统发育树显示不同标本与牧场来源大肠埃希菌分离株间进化关系存在交叉,同一牧场中环境来源及动物来源菌株间,不同牧场来源分离菌株间皆存在较近的亲缘关系,提示携带mcr-1大肠埃希菌在本地区存在克隆传播。结论1.mcr-1基因为主要基因型别,多定位于质粒,可在菌间播散;大肠埃希菌为主要携带菌株。2.mcr-1基因环境以traL-mcr-1-ymoA-topB-yhcR-xerC为多见;耐药基因在本地区存在横向传播。3.牧场来源菌株携带多种耐药基因,提示自然环境或为耐药基因的天然储存库,耐药基因存在动物、环境与人之间的相互传播风险。