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3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1,PDPK1orPDK1)属于AGC蛋白激酶家族(cAMP和cGMP依赖性的蛋白激酶C)的一员,它能磷酸化下游的许多蛋白,如Akt、p90RSK、p70S6K、SGK和PKC等。因此PDK1的活性对下游激酶以及各细胞功能有着重要的影响,但是病毒感染是否影响PDK1的活性,尚不可知。为了解病毒感染是如何影响PDK1的活性,我们检测了不同病毒感染刺激对PDK1活性的影响。发现禽流感病毒、禽双RNA病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒分别感染293T,293T/DF-1和PK-15细胞,均能诱导一条分子量为210kDa左右的PDK1修饰条带,进一步的实验证实,此条带为SUMO化修饰的PDK1。过表达FLAGPDK1和HASUMO1后,感染IBDV,并于感染后1、3、6、12h收样进行IP,通过FLAG抗体来钓,并用抗HA抗体来检测,可以在210KD左右的位置检测到条带,进一步证明PDK1的SUMO化修饰。通过网站预测到PDK1的SUMO化修饰位点分别为第207位、第296位和第495位赖氨酸,将这三个位点的赖氨酸同时突变为精氨酸后,PDK1的SUMO化修饰水平大大下降。同时还发现PDK1点突变后能够抑制下游AKT和S6K的磷酸化。此外,转染VP3的细胞中,AKT和S6K的磷酸化水平均明显上调。因此,本研究内容显示,病毒感染能够诱导PDK1的SUMO化修饰,并且PDK1的SUMO化修饰对下游AKT和S6K的磷酸化活性有着重要的影响。既然PDK1的SUMO化修饰在胞内有着重要的作用,那么胞内调控PDK1 SUMO化的机制就尤为重要。用PDK1作为诱饵蛋白来钓取胞内蛋白,发现PDK1能钓下110KD左右的条带,经过质谱鉴定发现这个条带为VPS34。我们采用CO-IP技术和PULL DOWN技术验证了 PDK1和VPS34的互作为直接互作。进一步实验证明过表达VPS34能够抑制PDK1的SUMO1修饰。同时我们发现VPS34能够破坏PDK1与UBC9的互作,从而抑制UBC9催化PDK1的SUMO化修饰。因此,研究表明VPS34能够负调控PDK1的SUMO化修饰。SUMO化对于PDK1蛋白功能的发挥具有重要作用,但是PDK1的SUMO化修饰对于调控其底物AKT活性的机制目前尚不清楚。超高分辨结果显示,PDK1的SUMO化修饰能够促进PDK1转移至膜周,并且和AKT定位在一块。免疫共沉淀结果进一步确认了 SUMO化能够促进PDK1和AKT的互作。而PDK1和AKT的互作对于AKT的磷酸化是必须的。另外,研究表明IBDV通过VP3与VPS34互作,从而破坏了 VPS34和PDK1的互作,并因此促进了 PDK1的SUMO化。对VP3的功能域进行分析,发现VP3通过CC3结构域与VPS34发生互作。而VP3通过CC1结构域与Beclin-1发生互作。但是VP3是通过CC3来调节PDK1修饰条带和AKT的活性。因此可以判定VP3是通过VPS34,而非Beclin-1来调节AKT的活性。同时研究还表明,VP3是通过AKT通路而非Beclin-1来抑制细胞自噬的。因此本章研究表明病毒感染可通过VPS34和PDK1的互作来调节PDK1的SUMO化状态,并进一步调节AKT的活性,从而调控病毒的感染。