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人绝经期促性腺激素(human menopausal gonadotropin,HMG),是人脑下垂体前叶嗜碱性细胞分泌的糖蛋白促性腺激素,包含等比例的卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、促黄体激素(luteinizing hormone(LH),一般由围绝经期妇女尿液中进行提取分离,主要作用因子为FSH。临床上HMG主要应用于治疗女性排卵障碍导致的不孕症,为促排卵主要药物。另外,也用于男性激素水平低下导致的精子过少或活力不足,妇女闭经,月经不调及男女性机能失调等症。近年来,尿液收集难度、粗品生产成本加大,而国内药企的粗品收购价格偏低,并且要求统一粗品生产工艺,使国内中间产品生产企业多倾向于将原料药出口国外药企,同时,国外的药企对原料生产工艺无严格限定,为HMG粗品生产企业研究高纯度HMG,进而出口、获取更高收益带来动力。目前,HMG的纯化主要有乙醇抽提、离子交换、疏水层析、多元层析、染料/抗体亲和层析等方法。本课题旨在研究HMG纯化,建立品质稳定的高纯度HMG纯化工艺。研究内容:优化并比较硅胶、硅酸铝、大孔吸附树脂对HMG粗品的提纯效果、活性收率;优化并比较乙酸铵-乙醇抽提与乙醇二级沉淀对HMG粗品的提纯效果;经粗品提纯处理后的HMG初纯品实验室规模层析纯化研究,通过离子交换、疏水层析及凝胶过滤层析等步骤获得最终的高纯度HMG。研究结果:硅胶吸附对粗品的提纯效果不明显,大孔吸附树脂提纯倍数在1.57以上,收率58%,硅酸铝提纯倍数在1.58以上,收率62%;乙醇二级沉淀提纯倍数仅为1.58,相对的乙酸铵-乙醇抽提处理,提纯倍数在1.7,但收率偏低,仅40%,本文研究了粗品溶液乙酸铵-乙醇二级沉淀,发现提纯倍数略降,但收率有明显提高,可达76%以上;本文在优化苯基疏水柱之后,纯化倍数最高可达5倍左右,活性收率70%以上。比较阴阳离子层析纯化效果,可知DEAE阴离子交换层析纯化效果最佳,纯化倍数最高可达2.8倍左右,活性收率81%以上。经过前期实验摸索,尝试在DEAE纯化步骤采用流穿工艺,尽大可能避免活性损失,则HMG经纯化后,纯化倍数最高可达3.16倍左右,活性收率85%以上。在DEAE与Phenyl层析纯化后,选用S-200进行最后的纯化步骤,纯化过程重复三次,产品平均FSH免疫活性可达43 IU/mg以上,生物活性35 IU/mg以上,活性收率在48%-52%。研究结论:1、HMG粗品经初步纯化处理,可去除部分杂质,活性最高提高1.78倍,收率最高76%,经多种方法比较,综合活性及收率考虑,选择乙酸铵-乙醇二级沉淀法进行粗品处理最佳。2、层析纯化最佳工艺为:DEAE-sepharose-FF阴离子柱流穿液,经冷冻干燥浓缩,脱盐柱置换缓冲液上Phenyl-sepharose-ls疏水柱,洗脱液经脱盐柱后上S-200层析,最终收集液冷冻干燥。此工艺下,高纯度HMG中FSH免疫活性可达43 IU/mg以上,生物活性35 IU/mg以上,活性收率在48%以上。