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目的:自由基对细胞和组织的氧化损伤会导致许多疾病的发生发展,其中尤以脑组织神经元受氧化损伤后危害最大,不仅可以导致如阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病,而且也与失眠关系密切。γ-氨基丁酸(GABA)是大脑中最重要的抑制性神经递质,通过与GABAA受体结合发挥突触后抑制作用,诱导睡眠的发生。沉香,自古被用作镇静安神的上品,现代药理学研究表明其药理活性组分主要来自于挥发油,但是沉香挥发油对中枢神经系统作用的分子机制尚不明了。因此,本研究通过体外培养大鼠海马神经元,用过氧化氢溶液对神经元造成氧化损伤模型,并给予不同浓度剂量的沉香挥发油干预神经元,探究沉香挥发油抗氧化损伤、对GABA及其GABAA受体的影响。方法:1.神经元原代培养与鉴定(1)取材与细胞培养:取出生1-3天内的Sprague-Dawley大鼠,雌雄不拘。取出大脑后,小心剥离海马组织作为神经细胞原代培养来源。(2)免疫荧光鉴定:当神经细胞培养至第6天时,细胞基本成熟,胞体圆大透亮、折光性强,树突与轴突粗长且彼此交织成网。采用神经元特异性标记物--神经细胞骨架成分微管相关蛋白2(MAP2)进行鉴定,胶质细胞不被着色,使用DAPI染细胞核,共表达MAP2和DAPI的阳性细胞鉴定为神经元,并计算所培养细胞中神经元的纯度。2.分组与造模给药待神经元培养成熟,将细胞分为5组,分别为空白组、模型组、沉香挥发油低剂量组(5 mg.L-1)、沉香挥发油中剂量组(10 mg·L-1)、沉香挥发油高剂量组(20mg·L-1)。空白组不作处理,其余各组均给予150 μmol·L-1 H2O2造模12h,沉香挥发油各组在造模前分别用不同浓度沉香挥发油干预细胞24h。3.指标检测CCK8法检测神经元细胞生存率;ELISA法检测细胞上清液GABA含量;RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测GABAA受体α1、β2和γ2亚基mRNA表达;Western Blot检测GABAA受体α1、β2和γ2亚基蛋白表达。结果:1.形态学观察海马神经元接种后2h开始贴壁,4h后基本贴壁完全。培养第1天可见神经元胞体小而透亮呈圆形,细胞分布均匀。培养第2天胞体呈现光晕,有立体感,开始从胞体伸出短小突起。培养第4天细胞胞体逐渐增大,折光性增强,树突增多,轴突长度增加,各个神经元之间开始形成网络连接。培养第6天神经元细胞基本成熟,突起进一步增多变长,突起直径增加变粗,神经元之间互相形成网络,连接更加紧密,有的神经元开始聚集成簇。2.免疫荧光鉴定待神经细胞培养至第6天形态成熟时,进行免疫荧光法染色,共表达MAP-2和DAPI的标记为阳性细胞,鉴定为神经元,在荧光细胞成像仪上随机选取10个视野计数阳性细胞。经计算,阳性细胞数/视野下总细胞数的百分比值均达90%以上,所培养细胞中神经元纯度很高。3.CCK-8 结果与空白组比较,给予150μmol·L-1 H2O2造模12h后细胞的存活率显著降低,约为22%(P<0.01);与模型组相比,沉香挥发油低剂量组、中剂量组细胞存活率有所提高但不具有统计学差异(P>0.05);沉香挥发油高剂量组神经元存活率显著提高,其差异具有统计学意义(P<0.05)。4.ELISA 结果与空白组比较,模型组细胞上清液中GABA含量显著低于空白组,约为0.67μmol·L-1(P<0.01);与模型组比较,沉香挥发油低剂量组细胞上清液GABA含量轻微增多但数据无统计学差异(P>0.05);沉香挥发油中剂量、沉香挥发油高剂量组海马神经元细胞上清液GABA含量显著高于模型组,具有显著的统计学差异(P<0.01)。5.RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳结果与空白组比较,模型组GABAA受体α1、β2和γ2亚基mRNA表达明显降低(P<0.01);与模型组相比,沉香挥发油低剂量组的mRNA表达有所提高但不具有统计学差异(P>0.05);沉香挥发油中剂量组、沉香挥发油高剂量组GABAA受体α1、β2和γ2亚基的mRNA表达相比模型组有显著提高,差异具有统计学意义(P<0.05)。6.Western Blot 结果与空白组比较,模型组GABAA受体α1、β2和γ2亚基蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,沉香挥发油低剂量组GABAA受体α1、β2和γ2亚基的蛋白表达水平升高,但结果不具有统计学差异(P>0.05);与模型组比较,沉香挥发油中剂量组、沉香挥发油高剂量组GABAA受体α1、β2和γ2亚基的蛋白表达水平均显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:1.沉香挥发油能够提高受氧化损伤神经元的存活率,对神经元具有一定的保护作用;2.沉香挥发油能促进受氧化损伤神经元γ-氨基丁酸的合成和释放,提高细胞上清液中GABA的含量;3.沉香挥发油能提高GABAA受体α1、β2和γ2亚基mRNA表达,促进GABA与GAB AA受体结合;4.沉香挥发油能提高GABAA受体α1、β2和γ2亚基蛋白表达,促进GABA与GAB AA受体结合。