樱桃耐涝相关基因的克隆与表达分析

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樱桃为蔷薇科樱属落叶果树,味美形娇,营养丰富,经济效益高,是我国大面积栽培的高档果品。但其根系浅,对环境变化反应敏感,不耐涝。在樱桃栽培过程中,由于降水不均、排水不良等因素,涝害时有发生,常造成严重的经济损失。因此,采取各种手段,尤其是现代分子生物学技术,进行樱桃耐涝性的遗传改良与种质创新具有重要意义。本文以筛选出的耐涝樱桃种质’沂蒙山樱’和敏涝樱桃种质’矮化樱桃’为试材,克隆了与植物耐涝相关的PsERF和PsCIPK基因、与碳水化合物代谢和根系发生相关的PsPDC、PsADH、PsSUS、PsRAMY和PsEXP基因的cDNA序列,研究了淹水胁迫和恢复处理过程中上述基因在耐/敏涝樱桃种质中的时空表达特性,并通过分析樱桃PsERF和PsCIPK基因与PsPDC、PsADH、PsSUS、PsR4MY和PsEXP基因在淹涝胁迫下表达情况的一致性和相关性,试图探明樱桃应答淹涝胁迫的响应途径,阐明樱桃种质耐涝能力强弱差异的分子机理,确定调控樱桃耐涝性的关键基因,为今后通过基因工程手段进樱桃耐涝性的分子遗传改良与种质创新奠定基础。主要研究结果如下:1、以耐涝种质’沂蒙山樱’叶片为材料,采用RACE法克隆得到了樱桃PsERF和PsCIPK基因的全长cDNA序列,PsERF基因cDNA全长1625bp,共编码382个氨基酸,PsCIPK基因cDNA全长1846bp,共编码459个氨基酸。荧光定量表达结果显示,淹涝胁迫过程中,耐涝种质’沂蒙山樱’中PsERF基因的表达量明显上升,而不耐涝种质’矮化樱桃’中PsERF基因的表达水平显著低于’沂蒙山樱’,且整体呈缓慢降低的趋势。PsCIPK基因尽管在淹涝第一天的表达下降,但此后该基因在’沂蒙山樱’中的表达量迅速上升,而在’矮化樱桃’根系中则持续下降,说明PsERF和PsCIPK基因与樱桃耐涝性密切相关。2、以’沂蒙山樱’为试材,采用RACE法克隆得到了樱桃PsEXP基因的全长cDNA序列,该cDNA全长1290bp,具有起始密码子、完整的开放阅读框(837bp)、终止密码子、5’非编码区(2bp)、3’非编码区(441bp)和poly(A)尾巴(10bp),共编码278个氨基酸。荧光定量表达结果显示,淹涝胁迫下,耐涝’沂蒙山樱’叶片和根系中PsEXP基因的表达量总体呈现下降趋势,这可能是樱桃在淹涝期间为了减少能量的损耗,通过降低PsEXP基因的表达来抑制植株的生长。而’矮化樱桃’的根系中PsEXP基因的表达量在淹涝第一天急剧上升,此后迅速回落并保持在较低水平,可能与敏涝种质根系的逆境响应有关,但PsEXP基因表达量的大幅增加可能大量消耗’矮化樱桃’中的储存能量,导致抗涝能力下降。3、以’沂蒙山樱’为试材,采用了 RACE方法克隆了樱桃糖代谢相关基因PsPDC、PsADH、PsSUS和PsRAMY的全长或部分cDNA序列。PsPDC基因cDNA全长2070 bp,PsADH基因cDNA片段长603 bp,PsSUS基因cDNA全长2737 bp,PsRAMY基因cDNA片段长1494bp。淹涝胁迫下,PsPDC、PsADH基因表达量的持续升高,乙醇发酵途径占更大比重,使得淹涝条件下’沂蒙山樱’具有更高的无氧呼吸速率,从而为细胞维持必要的生命活动提供能量。而PsSUS的表达量总体呈下降趋势,可以抑制叶子的伸长与生长,从而降低逆境下的能量损耗。此外,淹涝过程中PsRAMY基因在两个樱桃植株中的表达量总体呈上升趋势,在’沂蒙山樱’中,淹涝第4天的表达量比淹涝前约高出2.2倍,而在’矮化樱桃’中却高出约3倍,说明淹涝期间’沂蒙山樱’比’矮化樱桃’的淀粉消耗率更低,从而使’沂蒙山樱’有更多的淀粉储备以应对可能持续的涝害。4、综合前述研究,本研究提出了樱桃耐涝的可能机制:淹涝胁迫下,樱桃植株体内乙烯不断积累,引起植株中PsERF、PsCIPK基因的表达量升高,而PsERF、PsCIPK基因的表达促进了 PsPDC,PsADH和PsRAMY基因的表达,同时抑制了 PsSUS和PsEXP基因的表达(图5-1),以抑制植株生长和能量消耗。但随着淹涝时间的延长,耐涝樱桃体内淀粉含量出现匮乏,导致PsRAMY的基因在叶片中表达变缓,在根系中则开始降低。与此同时,乙醇发酵相关基因PsPDC,PsADH表达量开始上升,新陈代谢变缓,沂蒙山樱开始以无氧呼吸为主,以抵御淹涝所带来的伤害。
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