论文部分内容阅读
近年来,热激蛋白90(Hsp90)作为抗癌药物的一个分子靶标,在抗肿瘤药物的研究中备受关注。苯醌安莎类抗生素格尔德霉素(Geldenamycin, GM)被认为是第一个天然的Hsp90抑制剂。格尔德霉素通过特异性地竞争抑制Hsp90氨基端的ATP酶活性,致使依赖于Hsp90的多种肿瘤相关蛋白降解,从而抑制肿瘤细胞的生长或诱导其死亡。我们在前期工作中从一株放线菌新种自溶链霉菌(Streptomyces autolyticus)的次生代谢产物中发现了格尔德霉素和自溶霉素。但是目前对于它们生物合成过程中的调控机制尚不清楚,阻碍了我们通过遗传改造提高这些化合物的产量或发现新的结构类似物。为此,我们研究了三个调控基因almRI、almRII和orf17在格尔德霉素生物合成中的功能和调控机制。首先,我们对野生型和almRl及almRII突变株在不同发酵时间胞内和胞外的发酵产物进行了分析。结果显示,在敲除了almRl和almRII之后,突变株均不产格尔德霉素,由此说明almRl和almRII在格尔德霉素生物合成过程中起正调控作用。对比野生型和突变株的发酵产物发现有三个化合物产量有较大波动,经过分离纯化和结构解析得知此三个化合物为洋橄榄叶素及其类似物。在敲除了almRl和almRII之后,它们的产量均有大幅提升,且大部分在胞内。由此可知,almRl和almRII不仅参与了格尔德霉素的生物合成,可能对洋橄榄叶素的生物合成也有调控作用。我们运用Real-time PCR对almRl和almRII在不同发酵阶段的表达进行了分析,结果显示在发酵中前期almRl的表达量与格尔德霉素的产量呈正相关性；almRII在格尔德霉素大量积累前的发酵第5天表达量达到了最大值。为了寻找AlmRl和AlmRII调控的靶基因,我们采用了PT-PCR的方法对格尔德霉素生物合成基因簇中一些基因的表达进行了分析。同时,还对野生型、almRl和almRII突变株进行了转录组测序。综合对比两个结果,在格尔德霉素生物合成基因簇中,almAI、almAII、almAIII、almN、almK、almP和almF在突变株中的表达量下降,故这七个基因可能是AlmRl和AlmRII调控的靶基因。此外,我们采用Red/ET一步PCR敲除法成功构建了orf17的基因敲除突变株。对orf17突变株的发酵产物分析显示,在敲除了orf17后格尔德霉素的产量降低,说明orf17在格尔德霉素生物合成中起正调控的作用。本研究的主要目的在于探究调控基因almRI、almRII和orf17在格尔德霉素生物合成中的功能。该研究有助于阐明格尔德霉素生物合成的调控机制,为进一步对产生菌进行遗传工程改良奠定基础。