黄萎病是造成世界棉花产量和品质降低的主要病害之一。研究棉花抗病机制,鉴定抗病基因可为棉花抗病分子育种提供理论基础和基因资源。在植物抗病过程中,多种蛋白质、酶的相互合作,共同完成了植物抗病信号的产生和传递。泛素化修饰系统是真核生物体内主要的蛋白质调控路径,广泛参与了对生物体内大多数蛋白质的修饰降解行为。近年来研究发现,众多E3泛素连接酶参与了不同物种对相应病原菌的抗性调节。本研究对棉花一个参与抗黄萎病调控的E3泛素连接酶基因的功能进行了研究,并对棉花中PUB基因家族进行了聚类分析,取得的主要结果如下:1.序列分析表明,我们获得的对棉花黄萎病有响应的E3泛素连接酶基因与拟南芥中具有免疫调节作用的PUB17具有较高的同源性,故命名为GhPUB17。表达分析发现利用棉花黄萎病菌株V991,植物抗生物逆境相关激素SA和MeJA体外处理棉花幼苗后,提取总RNA检测GhPUB17表达水平,结果发现GhPUB17均被诱导上调表达。鉴于此结果,我们对其在棉花中的表达量进行了调控,详细研究其抗黄萎病功能。2.通过病毒介导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)及RNAi干涉技术抑制GhPUB17在棉花中的表达,棉花植株对黄萎病菌的抗性得以增强。超量表达GhPUB17后,转基因棉花材料对黄萎病的抗性明显弱于野生型对照及抑制GhPUB17基因表达的材料。接种灰霉病原菌后发现,所有棉花材料对该病原的抗性无显著性差异,表明GhPUB17可能特异性参与了棉花对黄萎病的抗性调控。3.使用qRT-PCR方法检测GhPUB17各种转基因株系材料接种黄萎病菌后抗病相关基因的表达变化。结果发现JA和SA信号路径标志基因在各个取样时间点的表达趋势一致,不因GhPUB17株系不同而存在差异,这说明GhPUB17在棉花抗病信号网络中的作用位置可能独立于SA和JA信号路径。4.通过蛋白互作实验鉴定到棉花亲环素GhCyP3可以与GhPUB17互作。通过VIGS方法抑制GhCyP3表达后接种V991,发现棉苗的抗病性降低,表明其在棉花抗黄萎病过程中具有正向调控作用。进一步研究发现GhCyP3蛋白能够抑制GhPUB17的E3泛素连接酶活性。此外本研究还发现,GhCyP3蛋白本身具有抗菌肽活性,体外培养状态下可有效抑制黄萎病菌孢子的增殖。这些结果证明GhCyP3在棉花抗黄萎病方面存在多重调控作用。5.为了本课题后续对PUB基因家族成员的功能进行系统性分析,我们对棉花基因组中的PUB基因进行了检索。以拟南芥的PUB基因序列为参考,我们在陆地棉基因组中BLAST比对发现了77个PUB基因家族成员。聚类分析后发现,这77个基因可分为14类。通过对棉花组织表达与黄萎病菌诱导表达转录组数据的分析,我们发现这些基因在棉花各组织差异表达,且其表达量受黄萎病菌诱导。我们从已发表的267份棉花栽培品种的重测序数据中选取了124份,并调查了这些棉花材料对黄萎病的抗性数据。同时我们分析了这124份材料基因组中PUB基因的变异情况,并将其与材料的抗性相关联,发现部分PUB基因编码区与启动子区域的SNP与InDel位点可能与棉花对黄萎病的抗性相关联。以上研究结果证明棉花E3泛素连接酶GhPUB17负调控棉花抗黄萎病,但亲环素GhCyP3可以抑制GhPUB17活性,并抑制病原菌生长,同时PUB基因家族的其他成员可能也参与了棉花对黄萎病的免疫调控。这为棉花抗病分子育种提供了理论基础和基因资源。