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研究目的原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一,在我国的肝癌死亡率高居恶性肿瘤死亡率的第二位。目前肝癌的诊断及治疗水平有了很大的提高,但肝癌患者的长期预后仍不理想,主要与肝癌手术后极易复发及发生转移有很大的关系。肝癌是典型的富血管肿瘤,肿瘤血管的发生在肝癌的进展过程中起到非常重要的作用,因此以抗血管新生为靶点的放射免疫联合治疗是目前治疗肝癌的研究热点。研究发现肿瘤血管形成是一个极其复杂的过程,受多种因子的共同调节,其中Endoglin(ENG)在新生血管的形成中起着重要的作用,研究证实ENG与常用的肿瘤标志物(CD34和CD31)相比,能更特异、敏感的代表肿瘤血管的生成及或肿瘤转移。目前已有研究发现原发性肝癌组织中ENG的mRNA表达量明显高于正常肝组织,ENG可以用于肝癌的微血管标记,而ENG是否可以用做肝癌细胞治疗靶点的研究尚未见报道。本研究选用绿色荧光蛋白标记的肝癌细胞SMMC7721-GFP构建肝癌的裸鼠动物模型,在活体水平无创性地监测肝癌模型中肿瘤细胞的生长和转移,并对131I-anti-ENG mAb联合5-FU治疗肝癌的疗效进行实时观测和评估,旨在为肝癌ENG靶向的放射免疫联合治疗奠定实验基础。研究方法1.取对数生长期的人源肝癌SMMC7721-GFP细胞皮下接种,建立HCC裸鼠肝癌模型。2.采用荧光活体成像技术动态观察不同浓度细胞及肿瘤生长,统计细胞数目及肿瘤体积与荧光光子数之间是否具有相关性。WB法检测肿瘤细胞系、肿瘤组织及正常肝组织内ENG的表达。4.细胞增殖毒性实验(CCK-8)检测不同anti-ENG mAb浓度对肿瘤细胞及内皮细胞的增殖的影响。5.采用放射性碘化标记Iodogen法制备131I-anti-ENG mAb,经Sephadex G-25柱分离纯化,检测放化纯,体外稳定性及体内药代动力学分布。6.HCC裸鼠肝癌模型尾静脉注射131I-anti-ENG mAb后的不同时间点(1,12,24,48,72h)进行放射自显影显像。7.血管管型形成实验检测不同浓度的131I-anti-ENG mAb对内皮细胞血管形成能力的作用。8. HCC裸鼠肝癌模型随机分为131I-anti-ENG mAb组、PBS对照组、5-FU组及131I-anti-ENG mAb联合5-FU组,一周一次瘤内注射。治疗4周后处死小鼠测量肿瘤体积、重量并计算抑瘤率。免疫组化分析不同组治疗后ENG蛋白表达量的改变。研究结果1.成功制备肝癌SMMC7721-GFP小鼠模型,活体成像技术动态观察细胞数目与荧光光子数之间具有良好的相关性(r2=0.9247,P<0.01),同时裸鼠肿瘤体积与荧光光子数之间也具有很好的相关性(r2=0.925,P<0.01)。2.RT-PCR和WB实验表明SMMC7721-GFP细胞及肝癌组织中ENG表达明显升高,与对照组相比具有显著差异(P<0.01)。3.CCK-8实验表明不同浓度anti-ENG mAb对SMMC7721-GFP及HUVECs的抑制作用均具有时间及浓度依赖性。anti-ENG mAb (20ug/ml)对SMMC7721-GFP及HUVECs细胞的增殖抑制率分别达到39.9+0.96%,45.2±1.26%。4.成功制备131I-anti-ENG mAb标记率为97.4%,放化纯为92.8%,比活度为69.7±6.26MBq/umol具有良好的体外稳定性；药代动力学表明131I-anti-ENG mAb的体内代谢符合二室模型,其分布半衰期为7.1h,消除半衰期为144.5h,平均滞留时间为10h。5.磷屏放射自显影图像显示,注射131I-anti-ENG mAb后24h可获得清晰放射自显影图像,荷瘤鼠的移植瘤部位放射性明显浓聚(T/NT=6.44±1.01)。6.血管管型实验表明与对照组相比,’31I-anti-ENG mAb(20ug/ml)处理的HUVECs在不同时间的管型形成数目与同时间点的对照组相比显著减少(P<0.01)。7.HCC裸鼠肝癌模型治疗组中,与PBS组相比,131I-anti-ENG mAb组、5-FU组和131I-anti-ENG mAb联合5-FU治疗组荧光光子数目有不同程度的减少,其中联合治疗组荧光光子数最低；’31I-anti-ENG mAb联合5-FU治疗组与单独用131I-anti-ENG mAb、5-FU相比有显著差异(P<0.05)8.HCC裸鼠肝癌模型治疗4周后131I-anti-ENG mAb治疗组与对照组间比较肿瘤重量差异有统计学意义131I-anti-ENG mAb治疗组肿瘤体积为96±15mm3,重量为0.4±0.19g,抑瘤率61.95±0.27%; 131I-anti-ENG mAb联合5-FU组抑瘤率高达76±0.62%。9.免疫组化定量结果显示与PBS组相比,131I-anti-ENG mAb组,5-FU组及131I-anti-ENGmAb联合5-FU治疗组ENG表达量明显减少,但是131I-anti-ENG mAb联合5-FU治疗组ENG蛋白的表达量最低。研究结论本研究表明放射性碘化标记的131I-anti-ENG mAb制备简单、稳定性好,能够显著抑制肝癌细胞的增殖、明显减少血管管型的形成；HCC裸鼠肝癌模型瘤内注射131I-anti-ENG mAb能抑制荷肝癌裸鼠移植瘤的生长,131I-anti-ENG mAb联合5-FU治疗组移植瘤抑制率明显提高；活体成像技术可以动态观察肿瘤生长及监测肿瘤治疗效果,对肿瘤研究具有重要意义。为临床ENG靶向的肝癌放射免疫联合治疗奠定了实验基础。