背景和目的：　　目前1型糖尿病和部分2型糖尿病患者仍需终身依赖外源性胰岛素治疗，且不能改善远期并发症。近年胰岛器官移植的成功提示了胰岛细胞可以弥补胰腺细胞的不足而用于治疗糖尿病，但供体的严重不足限制了其在临床的应用。而移植由人胚胎干细胞诱导分化而来的胰岛素分泌细胞可能有助于解决供体不足的问题。至目前为止，大多数诱导分化方案获得的胰岛样细胞共表达胰高血糖素和/或生长抑素，仍不是功能完善的β细胞。在我们前期研究中，在末阶段添加外源性诱导因子Exendin-4得到C肽阳性细胞率高达90％，大大提高了胚胎干细胞的分化效率，但其共表达四种胰腺特异蛋白，属于不成熟的胰岛前体细胞。　　Hori等在鼠胚胎干细胞分化末阶段采用PI3K抑制剂 LY294002成功获得95%-97%的胰岛素阳性细胞，仅有2%-3%的胰高血糖素阳性细胞。但其干细胞来源于小鼠，且在培养中使用了血清培养基，这些动物源性因素限制了分化细胞的临床应用。PI3K分为四个亚型，被广泛研究的IA类PI3K主要由p110催化亚基（p110α，β，δ）和p85调节亚基构成的异源二聚体组成。然而究竟是何种构型的PI3K异二聚体参与人胚胎干细胞的定向分化还未见有所报导。因此，本实验尝试在无血清培养条件下，在诱导末阶段采用PI3K抑制剂LY294002诱导人胚胎干细胞定向分化，以期获得更加成熟的胰岛素分泌细胞；采用PI3KP110β抑制剂TGX-221初步探索PI3Kp110β对人胚胎干细胞定向分化的影响。　　材料和方法：　　1.人胚胎干细胞单克隆细胞系 PKU1.1由北京大学第三医院生殖医学中心陈贵安教授赠送。采用“五步诱导法”包括：人胚胎干细胞体外培养（HES阶段）；拟胚体的形成（EB阶段）；通过ITSF液筛选巢蛋白阳性细胞（ITS阶段）；添加B27、N2以及碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）扩增巢蛋白阳性细胞（N2阶段）；去除 bFGF，添加广谱的PI3K抑制剂LY294002诱导因子为实验组，添加前期研究采用的Exendin-4因子为对照组分别诱导人胚胎干细胞向胰岛样细胞的定向分化；添加 PI3KP110β特异性抑制剂TGX-221因子用于检测PI3KP110β对人胚胎干细胞定向分化的影响（诱导阶段）；　　2.胰岛样细胞通过免疫荧光染色检测胰腺特异蛋白的表达；　　3.通过实时定量PCR检测胰岛细胞相关基因的表达；　　4.通过胰岛素和胰高血糖素体外诱导释放实验初步评价胰岛样细胞体外释放功能；　　5.通过糖尿病鼠肾被膜下移植胰岛样细胞来评价胰岛样细胞在体情况下对糖尿病鼠血糖及糖尿病症状的影响；移植8周后处死小鼠，取出移植侧肾脏进行HE染色及免疫组织化学分析。　　结果：　　1.细胞经一系列培养，第五阶段LY294002诱导的胰岛样细胞数量减少，体积也较小；免疫荧光染色显示：74.5%胰岛样细胞表达C肽，27.2%细胞表达胰高血糖素，31.3%细胞表达生长抑素，胰岛素/生长抑素双染阳性率仅3.5%，相较于Exendin-4诱导因子表达更低水平的胰高血糖素及生长抑素；　　2.实时定量PCR结果显示：LY294002组及TGX-221组相较于Exendin-4组胰岛样细胞表达更高水平的胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽，且NKX6.1、MAFA和GLUT2等胰岛成熟相关因子基因表达也明显升高；LY294002组与 TGX-221组胰岛样细胞表达的大部分胰腺内分泌激素及成熟因子水平相似，但TGX-221诱导的胰岛样细胞的胰岛素基因表达量是LY294002的近一倍，是Exendin-4诱导胰岛样细胞的176倍；　　3.体外在高糖高钾刺激下LY294002组胰岛样细胞释放胰岛素量、胰高血糖素量均是Exendin-4组的4倍，LY294002诱导的胰岛样细胞具有快速释放胰岛素及胰高血糖素功能，这和胰腺组织细胞的功能相似；　　4.将LY294002诱导的胰岛样细胞移植到糖尿病模型鼠肾被膜下，一周后血糖开始下降并维持稳定的血糖至8周，改善了糖尿病鼠的随机血糖。另外，糖尿病鼠多饮、多食、多尿、精神、毛发等糖尿病症状得到了改善。移植8周后处死小鼠，取出移植侧肾脏进行组织学分析，苏木精-伊红染色显示胰岛样细胞在移植侧肾脏组织内存活；免疫组织化学分析显示，在小鼠肾脏边缘及肾实质内存在呈棕红染色的人胰岛素阳性细胞；移植的细胞也无成瘤性。　　结论:　　1.在无血清培养基下通过添加外源性诱导因子 LY294002成功诱导人胚胎干细胞定向分化为更加成熟的胰岛样细胞，胰岛素单染阳性率高，且在体外对高葡萄糖有反应，在体内可以改善糖尿病小鼠高血糖状态；　　2. PI3K p110β在调节人胚胎干细胞向胰岛样细胞的分化及成熟过程中发挥了重要作用。