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百日咳是由革兰阴性杆菌百日咳杆菌(Bordertella pertussis)引起的一种具有强传染性的呼吸系统疾病,是一种流行周期为2～5年的区域性疾病。疫苗是预防和控制百日咳流行的最有效的手段,19世纪30年代以来全细胞百日咳疫苗(whole pertussis vaccine,WPV)成功应用于临床,从很大程度上控制了百日咳的流行,但由于全菌疫苗的副反应及自身的局限性,导致接种覆盖率下降,百日咳发病率呈现明显上升趋势。因此,筛选、制备安全有效的抗原成分,研制新一代无细胞疫苗是目前百日咳疫苗研究的主攻方向。无细胞百日咳疫苗主要包括百日咳毒素(Bordetella pertussis toxin,PT)和丝状血凝素,其中减毒的百日咳毒素是无细胞组分疫苗的重要成分。百日咳毒素为发现的B.pertussis主要毒力因子之一,它是由6个亚单位(S1-S5)构成的A-B型毒素,其中,A原体由一分子的S1组成,为PT的毒性所在部位,PT的ADP-核糖转移酶活性和主要保护性抗原决定簇即位于该亚单位上,传统百日咳疫苗的毒副作用与S1亚单位的酶活性有关。由于PT基因的不连续性,使其不能直接体外表达。鉴于PT的主要保护性决定簇位于S1亚单位上,而且ADP-核糖转移酶试验表明,所有天然序列的rS1(recombinant S1)亚单位均具有酶活性,而部分变异的rS1亚单位均无可检出的酶活性,因此,突变的S1可能是良好的候选抗原。基于以上认识,本实验拟解决两个问题:一是百日咳毒素S1亚单位及其突变体高效表达问题。在这个过程中我们尝试过多种商品化的表达载体,如pET-22b、pET-28a、pET-11c、pQE-30等。并同时尝试融合表达是否能提高表达量,选用教研室自主研制的一种高效融合表达载体,其含有编码EspA伴体蛋白的核苷酸序列,使本身不表达或表达低的目的蛋白得到高效表达。EspA是肠出血性大肠杆菌O157:H7的Ⅲ型分泌系统相关蛋白,因此通过基因重组技术将EspA功能性肽段构建至表达载体上,从而达到促进外源蛋白高效表达的目的,并且EspA能够为目的蛋白提供潜在的粘膜佐剂功能。二是对S1及S1突变体rS1的生物学活性进行研究。主要结果如下:1. B.pertussis S1的克隆表达采用PCR法自B.pertussis PT基因组扩增编码S1的约702bp基因,构建至克隆载体pMD18-T中,通过酶切、测序鉴定阳性重组子。应用生物信息学软件DNAssist和GenBank数据库对已公布的B.pertussis S1基因序列进行相似性分析。改变原核表达载体和诱导条件优化表达方案。将含目的基因片段的重组载体转化至大肠杆菌中,经IPTG诱导表达,用AKTA-explore纯化仪纯化重组表达的蛋白S1获得纯度约80%的抗原蛋白。应用Tris-Tricine电泳对表达产物和纯化产物进行分析,并采用Western blot鉴定重组蛋白的免疫原性。2. EspA-S1融合蛋白的克隆表达采用重叠延伸PCR的方法,以EspA做为融合蛋白前端,与S1串联,在片段间引入5个氨基酸的linker PQDPP;将融合基因构建在原核表达载体pET-28a(+)中,经酶切及测序鉴定后,阳性重组子转化宿主菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导重组工程菌表达。Tris-Tricine电泳和免疫印迹鉴定融合蛋白。3.百日咳毒素S1突变体rS1(S1-9K/129G)的构建表达。运用基因工程的定点突变技术,构建S1突变体rS1(S1-9K/129G)。构建至克隆载体pMD-18T中,通过酶切、测序鉴定阳性重组子。将含目的基因片段的重组载体pQE30-rS1转化至大肠杆菌M15中,经IPTG诱导表达,用AKTA-explore纯化仪纯化重组表达的蛋白,获得纯度约87%的目的蛋白。应用Tris-Tricine电泳对表达产物和纯化产物进行分析。4.百日咳毒素S1突变体生物学作用研究。建立CHO细胞毒性模型。选用培养简单、生长周期较短、贴壁生长的CHO细胞,培养至对数生长期(OD600≈0.6),然后将贴壁生长在盖玻片上的CHO细胞与不同浓度的S1、rS1、PT于37℃,5%CO2共同孵育4h,姬姆萨染色及电镜观察。结果显示PT只要浓度达到20ng/ml即可使CHO细胞变形超过50%,而rS1即使达到了100ng/ml也无变形,S1对CHO细胞有变形效应。rS1与阳性对照PT及S1组差异显著(P<0.01)。小鼠白细胞增多(LP)试验。每组6只5至8周龄雌性BALB/c小鼠,分rS1、S1实验组,并设置阴性对照PBS组及阳性对照PT组。皮下肌注抗原蛋白(PT 0.5μg混于PBS中,其余量为3μg ) ,5日后每组每只小鼠采尾静脉血20μl并使用细胞计数池测定白细胞数。rS1实验组与PBS对照组促白细胞增多试验中未见明显差异(P>0.05),与PT阳性对照组有显著差异(P<0.01)。S1组与PT阳性对照组无显著差异(P>0.05),结果表明rS1实验组无促白细胞增多作用,而S1实验组仍有促白细胞增多效应。5. rS1作为百日咳疫苗候选抗原的免疫原性研究。用纯化后的rS1和S1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA检测蛋白免疫小鼠后血清特异性IgG水平。与PBS组相比,升高明显,差异极显著(p<0.001),与疫苗免疫组相比,差异显著(p<0.01)。rS1和S1组相比,无显著差异(p>0.05)。表明重组蛋白rS1和S1均具有很强的免疫原性。综上所述,本研究成功表达了B.pertussis S1、EspA- S1和B.pertussis rS1重组蛋白,与GenBank已公布的B.pertussis菌株基因序列具有高度同源性。纯化的重组蛋白rS1和S1,具有良好的免疫原性和免疫反应性,可以作为B.pertussis基因工程疫苗候选抗原。建立了CHO细胞毒性体外模型,通过对rS1和S1重组蛋白的生物学功能研究显示:rS1和S1均具有良好的免疫原性和免疫反应性,但S1仍保留有PT的毒性作用,而rS1则无此毒性。因此rS1可作为一个较为理想的候选蛋白。本课题的实施为研制百日咳疫苗奠定了良好的基础。