口蹄疫是当今世界危害最严重的家畜传染病,灭活疫苗接种是预防口蹄疫的主要措施。随着植物基因工程的发展,转基因植物表达抗原成为可能,相对传统疫苗植物是一种更安全、更经济的表达系统。本研究将口蹄疫病毒免疫原基因整合进二倍体玉米基因组,提取玉米叶片DNA,根据植株DNA的PCR检测,筛选阳性植株,为FMDV转基因可饲疫苗的开发奠定基础。由于植物生产外源蛋白技术已经成熟,使得利用植物生产口服疫苗成为可能,本研究从实际生产出发,选用玉米胚性愈伤组织为转化材料,构建了携带FMDV结构蛋白VP1基因及P12A-3C基因的植物表达载体并优化转化系统。具体结果如下:1)FMDV Asia1/HeBei株乳鼠毒,提取病毒总RNA,通过RT-PCR获得目的基因P12A和3C,将目的基因连接克隆载体,对结构蛋白P1、非结构蛋白2A、3C基因进行测序分析,P12A全长2247nt,编码749个氨基酸,3C全长639nt,编码213个氨基酸。同过引物设计PCR扩增引入酶切位点,构建pGEM-T-P12A-3C载体。再将P12A-3C片段从该质粒酶切下来,连接到pC1300-SOD载体上,构建植物表达载体pC1300-P12A-3C。测序结果证明载体成功构建并将其转化进入农杆菌,通过农杆菌介导法转化外源基因:2)根据玉米密码子偏好性优化FMDV O/HK/99毒株VP1序列、Asia 1型FMDVVP1序列、及大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位(LTB)和霍乱弧菌毒素B亚单位(CTB),合成1095bp的Kozak-LTB-linker-Asia/VP1和1101bp的Kozak-CTB-linker-O/VP1基因。构建植物双价载体pC1300-LTB-Asia1/VP1-CTB-O/VP1。并通过基因枪导入法转化外源基因;3)优化玉米转化系统,以N6及MS为基本培养基,选用玉米“18白”愈伤组织材料,低温生长并继代四次,活化的根癌农杆菌介导及基因枪导入法转化外源基因,暗共培养3d后,再潮霉素梯度筛选,培养抗性愈伤并分化出苗。用多效唑及生根粉控制植株生长,选用株高2.5-3cm的植株在壮苗生长培养基中生长。受调节剂调控植株抗逆性提高,其成活率达到25%。植株大田生长良好,并收到第一代转基因玉米种子。4)免疫原基因VP1和P12A3C分别以不同的方法转入玉米愈伤组织,转基因玉米PCR检测表明,FMDV免疫原基因P12A-3C整合到玉米基因组中。