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目的:脑卒中是导致人类致残和致死的主要病因之一,其中以急性脑梗死最为常见。脑水肿是导致急性脑梗死后机体死亡的首因。大量血管内物质透过破坏的血脑屏障涌入脑实质,脑容量的急速膨胀导致了机体的死亡。氧化应激损伤血脑屏障,形成血管源性水肿的病理机制已被充分证明。急性脑梗死发生后,脑组织内积累大量的活性氧自由基,不仅直接攻击血脑屏障膜结构,还触发由细胞膜上的离子通道失活的相关级联反应,导致血管的通透性增加,加重脑水肿。减轻脑水肿的治疗策略有利于降低急性脑梗死的死亡率和致残率。因此,开发保护血脑屏障的药物有望成为急性脑梗死的有效策略。我们前期研究发现,抗氧化药物白藜芦醇、双环醇和丹皮酚等可以改善脑梗死后血脑屏障的通透性。注射用丹参多酚酸(salvianolic acids,SAs)是从传统中药丹参中提取的多种丹酚酸的水溶性混合物,具有对抗心肌缺血损伤的作用,广泛应用于治疗心肌缺血性疾病。其主要由丹酚酸B(salvianolic acid B,SAB)、丹酚酸D、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸组成,各单体表现出以较强抗氧化作用为特点的多方面药理作用。其中SAB已在动物实验中证实有明确的脑保护作用。本实验复制小鼠永久性大脑中动脉栓塞模型(permanent middle cerebr alanery occlusion,p MCAO),应用SAs及阳性对照SAB进行干预,评价脑梗死后血脑屏障渗透性、神经功能、脑梗死体积、脑水肿,旨在证实其脑保护作用并探讨其可能机制。方法:采用成年健康雄性CD-1小鼠,应用改良的Longa线栓法制作小鼠p MCAO模型。实验一探究SAs的血脑屏障保护作用。72只小鼠随机分为四组(每组18只):Sham组,p MACO组,SAs组(p MACO+SAs 15mg/kg),SAB组(p MACO+SAB 10mg/kg)。药物干预组在大脑中动脉栓塞后即刻给予药物腹腔注射,相应的p MCAO组与Sham组给予等体积的生理盐水。其中每组6只于药物干预后即刻给予尾静脉注射2%伊文斯兰溶液(4ml/kg),24小时后心脏灌注生理盐水,留取脑组织进行伊文斯兰渗透量测定。每组其余12只于术后24小时进行脑保护作用检测:包括神经功能评分,脑水含量测定以及TTC染色法测定梗死体积。实验二进行SAs血脑屏障保护机制的探索。每组6只同时进行SOD活性和MDA含量检测,评定SAs抗氧化能力。每组3只蛋白免疫印迹法测定claudin-5,occludin,MMP-9和AQP-4蛋白表达量。结果:1注射用丹参多酚酸能改善神经功能缺损。术后24小时对Sham组、p MCAO组、SAs组、SAB组小鼠进行神经功能评分,用Mann–Whitney U检验做统计分析。除Sham组外梗死各组小鼠均出现评分各异的左侧肢体偏瘫,神经功能评分明显升高。药物干预的SAs和SAB两组神经功能评分明显低于p MCAO组,且具有统计学意义(P<0.05)。SAs和SAB两组比较神经功能缺损无明显差别。提示SAs能改善急性局灶性脑梗死小鼠的神经功能缺失,其效果与SAB相当。2注射用丹参多酚酸能减轻脑水肿。Sham组梗死侧脑组织水含量为79.67%±1.89%。p MCAO组小鼠梗死侧脑组织含水量明显升高至84.42%±2.87%(P<0.05)。给予药物干预后,SAs组和SAB组梗死侧脑组织含水量降至82.49%±2.89%,81.81%±1.68%,与p MCAO组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。SAs和SAB两组比较梗死侧脑组织水含量差异无统计学意义(P>0.05)。提示SAs能减少急性局灶性脑梗死小鼠脑水含量,其效果与SAB相当。3注射用丹参多酚酸能降低脑梗死体积。在p MCAO组出现苍白色梗死区域。与p MCAO组相比,SAs组和SAB组病变侧梗死体积明显减小,且差异有统计学意义(p MCAO vs.SAs,SAB:54.67%±3.14%vs.42.88%±2.75%,37.88%±1.29%,P<0.05),而SAs组和SAB组患侧梗死体积差异无统计学意义(P>0.05)。提示SAs能降低急性局灶性脑梗死小鼠脑梗死体积,其效果与SAB相当。4注射用丹参多酚酸能改善血脑屏障的通透性。在p MCAO术后24 h,通过测量脑中伊文斯兰的漏出量,来评价血脑屏障的通透性。蓝色区域表示伊文斯兰漏出,指示血脑屏障通透性增加。p MCAO组病变侧脑组织血脑屏障通透性明显增加(P<0.05 vs.Sham组)。SAs组和SAB组病变侧脑组织伊文斯兰透过量均明显低于p MCAO(P<0.05)。SAs组和SAB组比较,差异无统计学意义。提示SAs能降低急性局灶性脑梗死小鼠血脑屏障通透性,其效果与SAB相当。5注射用丹参多酚酸能增加机体抗氧化能力。本实验中与Sham组相比,p MCAO组24 h后小鼠梗死侧脑组织匀浆中总SOD和CU-Zn SOD的活性均明显下降,而SAs组与SAB组可明显提高两种SOD活性,减低MDA的含量,差异有统计学意义(P<0.05)。而SAs组与SAB组之间并无明显差异,说明SAs可以清除急性局灶性脑梗死后自由基的脑损伤,提高机体抗氧化损伤的能力,从而发挥脑保护作用,其保护作用与SAB相当。6注射用丹参多酚酸对claudin-5,occludin,MMP-9,AQP-4蛋白表达量的影响。Western blot检测结果显示:脑梗死后24小时claudin-5和occludin蛋白表达降低,而MMP-9和AQP-4蛋白表达升高。药物干预后claudin-5和occludin蛋白表达升高,MMP-9和AQP-4蛋白表达降低,SAs组与p MCAO组相比差异有统计学意义(P<0.05)。而SAs组与SAB组,差异无统计学意义。结论:我们研究发现,注射用丹参多酚酸具有脑保护作用,能降低脑梗死小鼠神经功能缺损,减轻脑水肿,减小脑梗死体积。进一步研究发现,注射用丹参多酚酸能够减轻梗死后血脑屏障的通透性,下调脑组织MMP-9和AQP-4的表达量,上调claudin-5和occludin表达量,同时提高SOD活性并降低MDA含量。保护作用与阳性对照物SAB相当。我们推断,注射用丹参多酚酸可以通过提高机体抗氧化能力,保护了血脑屏障,减轻脑水肿,进而保护梗死后脑组织。注射用丹参多酚酸有望成为治疗急性脑梗死的有效药物。