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卵母细胞体外成熟(IVM)是胚胎工程研究的重要基础环节,但体外成熟卵母细胞的质量与体内相比仍有很大差异。大量的研究表明褪黑素(MT)和C-型钠钛(CNP)在动物的生殖活动尤其是对卵母细胞的成熟发育具有重要的意义。因此本研究利用MT和CNP对绵羊卵母细胞进行体外成熟培养,以期进一步完善体外培养体系并研究卵母细胞体外成熟的调控机理,从而为绵羊的体外受精、核移植等生物技术的开展奠定基础。实验一研究了褪黑素对绵羊卵母细胞体外成熟的影响。免疫荧光检测表明在绵羊GV和MII卵丘颗粒细胞、卵母细胞上都表达褪黑素受体MT1和MT2,western blot检测表明MT1和MT2在壁颗粒细胞、GV和MII卵丘颗粒细胞及卵母细胞上都表达,且MT1在颗粒细胞和GV卵丘颗粒细胞上的表达显著高于GV卵母细胞、MII卵母细胞和卵丘颗粒细胞;MT2在MII卵母细胞上的表达显著高于GV颗粒细胞、卵丘颗粒细胞和卵母细胞及MII卵丘颗粒细胞;成熟液中添加10-9～10-7 mol/L褪黑素显著提高卵丘颗粒细胞扩展和极体排出率,且10-7 mol/L显著提高了卵裂率和囊胚率;RT-PCR结果表明10-7mol/L褪黑素对卵母细胞GDF9、DNMT1的表达没有影响但提高了卵母细胞上BMP15及卵丘颗粒细胞PTX3、HAS2、EGFR的表达;添加抑制剂Luzindole组极体排出率、孤雌激活后的卵裂率、囊胚率和孵化囊胚率与对照组相比没有差异,但显著低于MT组;MT显著降低卵母细胞的cAMP、增加颗粒细胞的cGMP。本研究结果说明MT主要是通过MT1受体发挥作用的。实验二研究了 CNP对绵羊卵母细胞减数分裂的影响。RT-PCR检测表明在绵羊壁层颗粒细胞、GV卵丘颗粒细胞和卵母细胞上CNP和NPR2都有表达,且壁层颗粒细胞上CNP含量显著高于卵母细胞和卵丘颗粒细胞,而卵丘颗粒细胞上NPR2显著高于壁层颗粒细胞和卵母细胞。在成熟培养液中添加200 nM CNP处理不同时间(4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h)的结果表明:CNP处理4 h内能显著抑制核成熟,6 h后抑制作用迅速降低,CNP处理16 h已有卵丘颗粒细胞完全扩展,说明CNP处理最佳时间是4 h且对卵丘颗粒细胞扩展没有影响。CNP处理绵羊COCs 4 h、8 h、12 h卵母细胞和卵丘颗粒细胞上相关基因的表达变化表明:卵母细胞上CNP、NP和MT18 h表达量最高,卵丘颗粒细胞上NPR2 4 h表达量最高,FSHR、LHR、MT1、MT2、EGFR总体呈上升趋势,说明卵母细胞发生GVBD需要CNP的参与,CNP能够促进成熟相关基因的表达。200 nM CNP处理共培养绵羊壁层颗粒细胞(MGC)和COCs 4 h、8 h、12 h结果表明:GC细胞上CNP、NPR2、MT1、MT2和LHR的表达量呈上升趋势,说明GC分泌CNP,同时促进了 GC上NMT1、LHR的表达;COCs上CNP也增加,主要可能是由于GC合成的CNP进入COCs,而COCs上NPR2在4 h表达量最高,充分说明了壁层颗粒细胞分泌CNP并通过卵丘颗粒细胞上NPR2发挥作用。本研究结果揭示了 CNP在4 h内能够抑制卵母细胞的减数分裂恢复,且不影响COCs的卵丘颗粒细胞扩展,其作用机制是通过壁层颗粒细胞分泌CNP作用于卵丘颗粒细胞上的NPR2受体,从而影响了卵母细胞和卵丘颗粒细胞上相关基因的表达,进一步影响COCs的体外成熟。实验三研究了 CNP和MT共同处理对绵羊卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎体外发育的影响。实验结果表明,CNP预处理4 h再继续成熟24 h和28 h组孤雌激活胚的卵裂率显著高于对照组,再成熟24 h组囊胚率显著高于对照组,而再成熟28 h组囊胚率和对照组没有显著差异。研究结果还表明CNP、MT单独或联合使用胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数都显著高于对照组;定量PCR结果表明,CNP、MT、CNP + MT三组CNP、NPR2、FSHR和EGFR都显著提高;CNP、MT、CNP + MT三组线粒体均匀分布比例显著提高,皮质颗粒完全迁移的比例显著提高。综上所述,利用CNP、MT进行绵羊卵母细胞体外成熟培养都能够促进胞质与核成熟的同步性,增加成熟相关细胞因子的分泌,从而显著提高卵母细胞体外成熟的质量,从而提高胚胎的发育能力。实验四研究了过表达AANAT基因对转基因绵羊生产效率的影响。研究结果表明OPS冷冻胚胎的产仔率、羔羊存活率和转基因阳性率与未冷冻胚胎没有显著性差异,但冷冻胚胎的后代平均初生重高于未冷冻胚胎,转AANAT阳性后代的超排效率和后代扩繁效率与对照组差异不显著,但显著高于阴性组,后代扩繁的窝产羔数显著高于对照组和阴性组,但扩繁后代初生重低于对照组。以上结果揭示了原核注射AANAT基因的胚胎过表达AANAT基因,提高了胚胎的褪黑素水平和后代卵母细胞的质量,进而提高了胚胎移植效率、转基因阳性率和后代的繁殖效率。综上所述,MT能够促进绵羊卵母细胞的体外成熟及孤雌胚胎的体外发育;CNP在4 h内能够显著抑制卵母细胞的减数分裂恢复;CNP、MT单独或者联合使用,都有利于卵母细胞的体外成熟,提高CNP、NPR2、FSHR、LHR、EGFR、MT1和MT2基因的表达及线粒体均匀分布和皮质颗粒完全迁移的比例;显微注射转入AANAT基因提高了胚胎的褪黑素水平,提高胚胎移植的效率和转基因后代的阳性率及转基因后代的繁殖效率。