1973年,第一条具有生物学功能的细菌质粒构建成功标志着DNA重组和分子克隆的开始。经过近40年的发展,基因重组技术已经是研究生物的最基本的技术操作了。尽管分子克隆是生物技术基本技术操作,却是后续实验的基础,没有高效的克隆效率是很难进行下面的实验的。目前实验室常用的克隆载体如pUC系列和pBluescript系列,所采用的筛选克隆的方法为蓝白斑筛选。然而由于种种因为,蓝白斑筛选并不能完全反应克隆的情形,即白斑有时并非重组克隆,有时需要筛选许多菌落才能得到正确的重组克隆,而这在需要克隆效率的构建文库实验中尤为不利。而我们以pBluescript KS(-)质粒为骨架,通过Overlap-PCR技术构建的全新载体,利用rpsl(ribosomal protein small subunit)作为负筛选标记,其重组效率高达到96％-100％,因此可以作为通用的克隆载体使用。　　 随着蛋白质组学的发展,越来越多的科学家对一些有特殊功能的蛋白质感兴趣。这些蛋白产物,不论是作为生化分析研究还是对其治疗或结构分析,必有三个共同点:可表达性、可溶性和可纯化。尽管蛋白表达不再是限制其发展的步骤,而蛋白纯化方法经过二十多年的发展也取得了突破性的进展,但是表达纯化出具有可溶性的蛋白质依然是该领域所面临的主要问题。通过加融合标签来提高目的蛋白的表达量和可溶性依然是最方便并广泛采用的技术。但是不同的融合标签对蛋白所提高的效果是不同的,因此需要选择合适的标签很重要。融合标签有可能对靶蛋白的结构或活性有一定的潜在影响,这时就需要将融合标签从融合蛋白上面切除。烟草蚀纹病毒蛋白酶具有酶切位点特异性和广泛的温度适应性,所以经常使用它将融合标签与目的蛋白切开。我们以pET-30a质粒为骨架,并加上五种不同的融合蛋白基因,构建的一系列的表达载体以满足蛋白表达的需要,并在融合标签的下游末端加入TEV蛋白酶专一性的酶切位点,这样就可以很容易的将融合标签与目的蛋白分离纯化。我们合成了TEV酶的基因并构建到表达载体上进行表达。然而表达的TEV酶有个严重问题即出现不可溶性组份而降低其酶切效果。所以我们将它的序列中的三个氨基酸替换并加上多聚精氨酸尾,并在其基因的前端加融合标签,观察其酶的表达量和它的稳定性及活性。