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目的心脏之外的组织或器官(如骨骼肌、小肠等)的短暂缺血再灌注,不仅能减轻自身对随后较长时间的缺血再灌注损伤,而且对远端的心脏也具有保护作用,即远端缺血预处理(remote ischemic preconditioning,RIPC),其为继缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)后的又一减轻心脏缺血后损伤的重要措施。吗啡是临床麻醉与镇痛中常用的阿片类药物。前期已经证实鞘内小剂量的吗啡预处理可以模拟RIPC,对在体大鼠缺血后心肌损伤具有保护作用。本研究拟探讨鞘内远端吗啡预处理(remote morphine preconditioning,RMPC)心肌保护作用的机制。方法成年雄性SD大鼠,体重250~300 g,建立大鼠鞘内置管和在体心脏缺血再灌注损伤的动物模型,心肌缺血和再灌注由结扎和开放左冠状动脉实现。实验分组:本实验分三个系列进行研究。第一部分:研究RMPC对心肌缺血后损伤的影响及心脏信号传导机制。研究分为假手术(SHAM)组、对照(CON)组和RMPC组。通过检测心肌凋亡数和心脏Akt、p-Akt和eNOS蛋白的表达,从而探讨PI3K-Akt-eNOS介导抗凋亡的机制在RMPC的心肌保护效应中的作用。第二部分:研究RMPC心肌保护作用的神经体液介导机制。在RMPC前鞘内注射内源性递质受体以及神经节阻断剂(CGRP受体阻断剂CGRP8-37、缓激肽受体阻断剂HOE-140、腺苷受体阻断剂8-SPT和神经节阻断剂HEX),另设各自的自身对照组。第三部分:研究RMPC心肌保护作用的中枢信号传导机制。在RMPC前鞘内注射NO-cGMP-PKG信号通路的抑制剂(NOS抑制剂L-NAME、GC抑制剂ODQ和PKG抑制剂KT-5823),以及观察胸段脊髓nNOS和PKG蛋白及mRNA的表达,进而证明RMPC心肌保护作用是否由胸段脊髓中枢NO-cGMP-PKG信号通路参与介导。鞘内远端吗啡预处理是在缺血前30 min内经5 min鞘内输注吗啡1μg/kg(用生理盐水稀释到10μl),停止5 min,共3个循环。观察指标包括:血流动力学和心肌病理学改变(以梗死区/危险区表示心肌梗死面积,is/aar);westernblotting技术分析心脏akt、p-akt和enos的蛋白以及胸段脊髓nnos和pkg蛋白的表达;tunel染色测定心肌细胞凋亡细胞数;比色法检测血清乳酸脱氢酶(ldh)水平;放射免疫法测定胸段脊髓组织cgmp的含量;硝酸还原酶法和比色法分别测定胸段脊髓组织no含量和nos活性;免疫组化染色测定胸段脊髓nnos和pkg蛋白的表达;rt-pcr测定胸段脊髓nnosmrna的表达。统计学处理:计量资料以均数±标准差(±s)表示,各组之间比较采用方差分析,两两比较采用t检验分析,p<0.05认为差异有显著意义。结果第一部分:1.血液动力学指标与sham组比较,con组和rmpc组在缺血30min和再灌注120min时点,hr、map和rpp均显著降低(p<0.05);与基础值比较,con组和rmpc组缺血30min、再灌注120min时hr、map和rpp均降低(p<0.05)。2.心肌梗死面积与con组比较,rmpc组显著降低了梗死区体积(is)和心肌梗死面积(is/aar),表明rmpc对在体大鼠心肌缺血/再灌注损伤有保护作用。3.tunel染色结果与sham组比较,con组大鼠心肌组织凋亡细胞数明显增多(p<0.01);与con组比较,rmpc组大鼠心肌组织凋亡细胞数减少(p<0.01)。表明rmpc可以降低心脏缺血后心肌细胞的凋亡。4.westernblotting检测结果各组大鼠心肌组织akt表达差异无统计学意义(p>0.05);与sham组比较,con组心肌组织p-akt表达上调(p<0.01),enos表达下调(p<0.01);与con组比较,rmpc组心肌组织p-akt和enos表达均上调(p<0.01)。表明心脏经历缺血后大鼠心肌处于p-akt激活和enos抑制水平;然而rmpc可同时激活心肌组织p-akt和enos。第二部分:1.血液动力学指标与con组比较,缺血前即刻hex组map降低,hex+rmpc组map、rpp降低(p<0.05),基础值、缺血30min和再灌注120min其余各组hr、map和rpp差异均无统计学意义(p>0.05);与基础值比较,缺血前即刻hex组map、rpp降低,hex+rmpc组hr、map和rpp均降低(p<0.05),各组缺血30min、再灌注120min时hr、map和rpp均降低(p<0.05)。2.心肌梗死面积与con组比较,除8-spt+rmpc组,差异有统计学意义(p<0.05)外;其余cgrp8-37+rmpc组、hoe-140+rmpc组和hex+RMPC组以及它们自身对照组(CGRP8-37组、8-SPT组、HOE-140组和HEX组)差异均无显著性(P>0.05);然而,与RMPC组比较均有显著性差异(P<0.01)。表明这些阻断剂自身对IS/AAR无影响;除8-SPT部分阻断RMPC心肌保护作用,其余均可完全取消RMPC心肌保护效应。3.血清中乳酸脱氢酶(LDH)水平与CON组比较,RMPC组血清LDH水平降低(P<0.01);而与RMPC组比较,CGRP8-37+RMPC组、8-SPT+RMPC组、HOE-140+RMPC组和HEX+RMPC组血清LDH水平升高(P<0.01)。第三部分:1.血液动力学指标与CON组比较,基础值、缺血前即刻、缺血30 min和再灌注120 min时点,其余各组HR、MAP和RPP差异均无统计学意义(P>0.05);与基础值比较,各组缺血30 min、再灌注120 min时HR、MAP和RPP均降低(P<0.05)。2.心肌梗死面积L-NAME+RMPC组、ODQ+RMPC组和KT-5823+RMPC组以及它们自身对照组(L-NAME组、ODQ组和KT-5823组),与CON组相比差异均无显著性(P>0.05);然而,与RMPC组比较均有显著性差异(P<0.01)。表明这些抑制剂本身对IS/AAR无影响,但均可完全取消RMPC心肌保护效应。3.Western blotting检测结果与CON组比较,RMPC组大鼠胸段脊髓nNOS、PKG蛋白表达明显增高(P<0.01)。4.放射免疫检测结果与CON组比较,RMPC组胸段脊髓cGMP的含量显著增加(P<0.01)。5.硝酸还原酶法和比色法结果与CON组比较,RMPC组胸段脊髓组织NO含量和NOS活性均显著增加(P<0.05,P<0.01)。6.免疫组化染色结果与CON组比较,RMPC组胸段脊髓背角区nNOS和PKG表达显著增加(P<0.05,P<0.01)。7.RT-PCR分析结果与CON组比较,RMPC组胸段脊髓nNOS mRNA的表达显著增加(P<0.01)。结论RMPC对在体大鼠心脏缺血后损伤具有保护作用。其的可能机制:1.RMPC的心肌保护作用与心脏PI3K-Akt-eNOS信号通路介导的抗凋亡机制有关;2.RMPC的心肌保护作用涉及神经与体液机制,体液因子主要包括CGRP、缓激肽和腺苷;3.RMPC心肌保护作用的与脊髓中枢NO-cGMP-PKG信号传导通路参与介导有关。