血管内皮细胞调控电离辐射后小胶质细胞表型转化及其相关机制研究

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目的:探究血管内皮细胞对电离辐射后小胶质细胞表型的调控作用,并探讨其可能的分子机制。  方法:(1)细胞免疫荧光染色检测10Gy照射后BV-2小胶质细胞M1和M2表型相关蛋白变达情况;(2)血管内皮细胞与BV-2小胶质细胞接受10Gy照射后,通过transwell小室进行共培养,通过细胞免疫荧光染色和Western blotting方法检测BV-2小胶质细胞M1和M2表型相关蛋白的表达变化;(3)Real-time PCR(qRT-PCR)和Western blotting方法检测10Gy照射后血管内皮细胞趋化因子FKN的mRNA和蛋白表达水平变化;(4)BV-2小胶质细胞饥饿处理3h后接受10Gy照射后,加入外源性FKN,通过细胞免疫荧光和Western blotting实验检测BV-2小胶质细胞中M1和M2表型相关蛋白的表达变化;(5)吞噬实验检测10Gy照射后,外源性加入FKN对BV-2小胶质细胞吞噬功能的影响;(6)Real-time PCR(qRT-PCR)检测10Gy照射后,外源性加入FKN对BV-2小胶质细胞炎症相关因子mRNA表达水平变化;(7)利用CX3CR1siRNA构建BV-2小胶质细胞CX3CR1表达下调模型,并与血管内皮细胞共培养,接受10Gy照射后,通过细胞免疫荧光染色和Western blotting方法检测BV-2小胶质细胞M1和M2表型相关蛋白的表达变化;(8)应用4周龄野生型(CX3CR1+/+)及CX3CR1纯合子(CX3CR1-/-)C57雄性小鼠,随机分为对照(sham)组和单纯照射(RT)组,每组10只,10Gy全脑照射后,收集不同时间点(3h,6h,24h,96h)小鼠脑组织,通过组织免疫荧光双染检测各组小鼠脑组织中小胶质细胞迁移能力,Western blotting方法检测脑组织中M1和M2表型相关蛋白变化。  结果:(1)10Gy照射后,细胞免疫荧光染色结果显示BV-2小胶质细胞M2表型标志物Arg-1和M1表型标志物iNOS表达均增加;(2)10Gy照射后,将血管内皮细胞与BV-2小胶质细胞共培养24h,细胞免疫荧光染色实验显示小胶质细胞M2表型标志物Arg-1表达增多,M1表型标志物iNOS表达减少,Western blotting方法显示小胶质细胞M2型标志物Arg-1的表达增多;(3)Real-time PCR(qRT-PCR)方法显示10Gy照射后,24h血管内皮细胞趋化因子FKN的mRNA表达水平增多;Western blotting方法显示10Gy照射后,24h血管内皮细胞趋化因子FKN的蛋白表达水平增多;(4)细胞免疫荧光染色实验显示10Gy照射后,外源性加入FKN作用24h后,小胶质细胞M1表型标志物iNOS表达水平降低,M2表型标志物Arg-1表达水平增高;Western blotting实验显示10Gy照射后,外源性加入FKN作用24h后,小胶质M1表型标志物TNF-α、iNOS表达水平降低,M2表型标志物Ym-1、TGF-β表达水平增高;(5)细胞吞噬实验显示10Gy照射后,外源性加入FKN后小胶质细胞吞噬功能增加;(6)Real-time PCR(qRT-PCR)方法显示,与单纯照射组相比,10Gy照射后外源性加入FKN,可使小胶质细胞促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6、iNOS的mRNA表达水平上调,抑炎因子IL-10的mRNA表达水平下调;(7)利用CX3CR1siRNA构建BV-2小胶质细胞CX3CR1表达下调模型,并与血管内皮细胞共培养,接受10Gy照射后,细胞免疫荧光染色实验显示与CX3CR1siNC组相比,CX3CR1表达下调组小胶质细胞M2表型标志物Arg-1表达减少,M1表型标志物iNOS表达增多,Western blotting方法显示CX3CR1表达下调组小胶质细胞M2型标志物Ym-1的表达减少,M1表型标志物iNOS表达增加;(8)组织免疫荧光双重染色显示,与野生型小鼠相比,10Gy照射后,CX3CR1-/-小鼠海马区小胶质细胞迁移能力减弱,Western blotting结果显示,与野生型小鼠相比,10Gy照射后,CX3CR1-/-小鼠脑组织中小胶质细胞M2表型标志物Ym-1,抑炎因子IL-10、TGFβ表达降低,M1表型标志物促炎因子TNF-α表达升高。  结论:通过体内外实验,我们发现10Gy照射后,血管内皮细胞可通过上调趋化因子FKN,进而通过FKN/CX3CR1通路促进小胶质细胞M2表型转化。
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