猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难为特征的、严重危害养猪业的主要传染性疾病之一,给世界范围的养猪业造成巨大经济损失。PRRS病毒(PRRSV)对宿主淋巴细胞有严格嗜性,其RNA基因组易变异,常规的疫苗设计策略难以产生理想的免疫效果,因此,探索防治该病的新方法有重要意义。RNA干扰(RNA interference,RNAi)作为新的有效抗病毒工具,其机制与建立在病毒蛋白基础上的传统的疫苗免疫机制不同,是转录后mRNA水平上的基因沉默机制,通过双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子阻断或者降低同源基因的表达而达到抗病毒复制的效果。在哺乳动物细胞中,21～23nt的小干扰dsRNA(small interfering RNA,siRNA)可以诱导同源基因特异表达抑制,为探索抗病毒研究提供了新思路。 本研究首先针对PRRSV中含量最高、相对保守的核衣壳蛋白(N)编码序列ORF7基因,使用http://www.ambion.com的靶位点筛选和设计工具,选取4个特异siRNA序列(siRNA95、siRNA179、siRNA218和siRNA294),同时设计一个无相关序列(siRNA-C)对照,利用一步PCR法产生包含鼠U6启动子的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达盒(shRNA95-PCR、shRNA179-PCR、shRNA218-PCR、shRNA294-PCR和shRNA-C-PCR),带shRNA表达盒的PCR产物分别与表达N蛋白的重组质粒pEGFP-ORF7共转染293T细胞,荧光显微镜下检测表达绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)细胞比例,快速筛选有效siRNA片段。筛选N-EGFP融合蛋白稳定表达293T细胞系,验证了筛选片段的基因沉默效果,在PRRSV感染的MARC-145细胞中证明筛选的siRNA片段可以明显减轻PRRSV引起的特异性细胞病变。 为了使shRNA获得长久表达并适合于大量制备,将PCR法制备shRNA表达盒插入到pEGFP-N1质粒载体,构建shRNA表达载体(pEN95-shRNA、pEN179-shRNA、pEN218-shRNA、pEN294-shRNA、pEC-shRNA),转染MARC-145细胞,在mRNA水平及蛋白质水平检测shRNA表达载体对PRRSV复制的抑制。结果证明pEN179-shRNA可以明显减轻PRRSV引起的特异性细胞病变;在间接免疫荧光分析(indirect immunofluorescent assay,IFA)和Western blot检测中,pEN179-shRNA处理细胞的PRRSV N蛋白阳性细胞及N蛋白表达量比对照的明显减少;荧光定量PCR(fluerenscence quantatitive PCR,FQ-PCR)和病毒滴定检测发现pEN179-shRNA处理细胞中N蛋白的mRNA比对照减少了96%,病毒滴度比对照减少了681倍。此外,pEN179-shRNA抑制效应在一定范围内呈明显的剂量依赖性。在检测pEN179-shRNA抑制PRRSV ORF7 mRNA的同时,对次要结构蛋白的mRNA表达水平的变化进行检测,结果表明,次要结构蛋白GP2、GP3、GP4的mRNA表达水平分别比对照减少了60%、30%、55%,证明PRRSV的复制受到了抑制,而且pEN179-shRNA的抑制作用是特异的。 为了了解次要结构蛋白GP2、GP3、GP4在病毒复制中的作用,针对各基因分别选取4个siRNA位点,构建相应的shRNA表达载体(21、22、23、24、31、32、33、34、41、42、43、44)。FQ-PCR筛选可以减少PRRSV感染MARC-145细胞中ORF2、ORF3、ORF4相应mRNA含量的特异shRNA表达载体,病毒效价滴定表明这些shRNA表达载体(23、24、31、34、41)处理细胞培养上清中的病毒滴度比对照低4.65～184倍,但IFA检测中没有发现明显差异,推测次要结构蛋白在病毒感染中有重要作用。