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对虾养殖是世界水产养殖的重要组成部分，然而近年来病原性疾病不断威胁着对虾养殖业的健康发展。为了制定有效的防治策略，人们开始更加关注对虾先天免疫防御的分子机制。虽然已有诸多研究报道对虾体内存在多种能响应病原胁迫的应激蛋白，但与鱼类等高等水产养殖动物相比，还大为落后。因此，有必要采取新的策略，对对虾如何响应病原刺激进行深入研究和探索。为此，本研究在优化对虾血浆低丰度蛋白纯化技术的基础上，采用分子生物学、蛋白质组学和免疫学等策略，对白斑综合症病毒（whitespotsyndromevirus，WSSV）刺激后的凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）血浆低丰度应激蛋白进行了鉴定与免疫学功能分析，所获主要研究结果如下：
1.对虾血浆低丰度蛋白纯化方法的建立
首先，采用超速离心纯化对虾血浆，发现高丰度蛋白血蓝蛋白（hemocyanin）可沉降于管底。SDS-PAGE分析显示，与对照组相比，超速离心可去除部分血蓝蛋白。同时，低丰度蛋白可得到较好的富集。
继而，采用分子筛凝胶层析（SupersoseTM6increase10/300GL,GEhealthcare,USA）技术对上述去除部分血蓝蛋白的血浆进行进一步分离纯化。结果显示，经分子筛凝胶层析去除血蓝蛋白后的血浆，其低丰度蛋白可得到有效的纯化。
由此说明，超速离心结合分子筛凝胶层析是一种有效的对虾血浆低丰度蛋白纯化方式。
2.WSSV刺激下血浆低丰度应激蛋白的鉴定
首先，采用上述建立的血浆低丰度蛋白纯化方法纯化WSSV刺激后对虾血浆样品，并进行iTRAQ（isobarictagsforrelativeandabsolutequantification）分析。结果发现，与对照组相比，感染WSSV后59个蛋白的表达量发生显著性变化，其中，Unigene31697、Unigene36916、Unigene14284、Unigene22593、Unigene11244、CL15、Unigene23065、Unigene6879、CL2720、CL1742、Unigene29120、Unigene22776、CL6041、Unigene25681、CL7960、CL3059、CL6072和CL7272等18个蛋白表达量显著上调2倍以上。由此提示，这些上调血浆低丰度蛋白可能与对虾响应WSSV应激有关。
继而，采用Real-timePCR分析WSSV刺激对上述质谱鉴定的上调血浆低丰度应激蛋白mRNA表达水平的影响。结果显示，WSSV刺激对虾24h之内，Unigene11244、Unigene36916和CL1742等8个蛋白在mRNA水平有不同程度上调，且变化趋势与iTRAQ结果基本一致，其中，CL1742（命名为LvTLAP）响应最为明显，在8h和24h其mRNA水平分别上调至3.5倍和5.3倍。由此说明，LvTLAP等8个血浆蛋白可能为对虾响应WSSV应激的新的潜在靶位。
3.LvTLAP免疫学功能与作用机制的研究
为进一步研究上述血浆蛋白对WSSV的响应机制，我们选取应激反应最为明显的未知蛋白LvTLAP进行深入研究。
3.1基因克隆、原核表达与抗体制备
采用基因克隆技术获取LvTLAP全长序列，发现其开放阅读框长为1092bp，编码363个氨基酸，理论pI/Mw为5.31/39.02kDa。生物信息学分析发现，LvTLAP含有一个Tryp-SPc结构域（aa118-357）。组织差异性表达分析显示，LvTLAP在各组织中均有表达，其中，在心脏中表达量最高，在鳃中表达量最低。
在上述基础之上，通过原核表达成功获得分子量约为65kDa的rGST-LvTLAP重组蛋白，进一步将重组蛋白免疫小鼠，制备LvTLAP多克隆抗体。Dot-ELISA分析显示，该抗血清能与rGST-LvTLAP发生特异性结合。由此说明，鼠抗LvTLAP抗体制备成功，可用于下一步研究。
3.2免疫相关性分析
首先，通过病原刺激实验分析LvTLAP对不同病原的响应，发现其在蛋白水平可以明显响应副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、海豚链球菌（Streptococcusiniae）和WSSV的刺激，分别在12、48和48h时蛋白表达量最高。其中，LvTLAP对WSSV响应最为明显，其表达呈先下降后上升的趋势，在12h表达量最低，在48h表达量最高，后者为前者表达量的4.86倍。
继而，比较分析敲降LvTLAP前后WSSV刺激下对虾死亡率的变化情况。结果显示，WSSV刺激120h后，与对照组（dsEGFP+WSSV）相比，干扰组（dsLvTLAP+WSSV）死亡率明显上升，存在极显著差异（p<0.01）。
由此说明，LvTLAP可能为对虾一种新的免疫应激相关蛋白，尤其与抵御WSSV感染密切相关。
3.3作用机制探索
首先，在亚克隆、原核表达LvTLAP结构域（aa118-357，命名为LvTLAPD）的基础之上，采用pull-down和MALDI-TOF/MS技术对LvTLAP的相互作用蛋白进行分析。结果发现，rGST-LvTLAPD与对虾血浆总蛋白孵育后，新增2条分子量分别为55kDa和25kDa的差异蛋白条带。经质谱鉴定，这两个蛋白条带分别与putativedyneinheavychain12-axonemal（DNAH12）和growthandtransformation-dependentprotein（GTD）具有高度同源性，推测其可能为LvTLAP的相互作用蛋白。
其次，结合文献相关报道选取GTD作为研究对象，采用基因克隆、原核表达、pull-down和Westernblot等技术深入分析LvTLAP和GTD重组蛋白（rHis-LvGTD）之间的相互作用。结果显示，与对照组相比，rGST-LvTLAPD可与rHis-LvGTD发特异性的结合。由此说明，LvGTD应为LvTLAP的相互作用蛋白。
最后，采用RNA干扰技术分析LvTLAP敲降后对LvGTD和血细胞凋亡情况的影响。结果显示，LvTLAP干扰后，LvGTD表达量显著性（p<0.05）或极显著性（p<0.01）上升。与之对应，促凋亡基因LvcytochromeC和Lvcaspase3表达量显著性上升（p<0.05），抑凋亡基因LvIAP1表达量显著性下降（p<0.05），同时，LvCaspase3/7活性极显著性升高（p<0.01）。通过流式细胞术检测发现，与对照组相比，干扰LvTLAP后血细胞凋亡比例明显上升。由此推测，LvTLAP可能通过LvGTD负调控血细胞的凋亡而参与对虾对WSSV的免疫防御。
综上所述，本研究在建立一种有效的对虾血浆低丰度蛋白纯化方式的基础之上，首次发现一种新的与对虾抵御WSSV有关的血浆低丰度应激蛋白LvTLAP，其作用机制可能与其通过LvGTD负调控血细胞凋亡有关。所获研究结果对深入阐明对虾免疫防御机制，寻找新的免疫防御靶位具有重要的理论意义和潜在的应用价值，促进我国对虾养殖业的健康、持续发展。
3.3作用机制探索
首先，在亚克隆、原核表达LvTLAP结构域（aa118-357，命名为LvTLAPD）的基础之上，采用pull-down和MALDI-TOF/MS技术对LvTLAP的相互作用蛋白进行分析。结果发现，rGST-LvTLAPD与对虾血浆总蛋白孵育后，新增2条分子量分别为55kDa和25kDa的差异蛋白条带。经质谱鉴定，这两个蛋白条带分别与putativedyneinheavychain12-axonemal（DNAH12）和growthandtransformation-dependentprotein（GTD）具有高度同源性，推测其可能为LvTLAP的相互作用蛋白。
其次，结合文献相关报道选取GTD作为研究对象，采用基因克隆、原核表达、pull-down和Westernblot等技术深入分析LvTLAP和GTD重组蛋白（rHis-LvGTD）之间的相互作用。结果显示，与对照组相比，rGST-LvTLAPD可与rHis-LvGTD发特异性的结合。由此说明，LvGTD应为LvTLAP的相互作用蛋白。
最后，采用RNA干扰技术分析LvTLAP敲降后对LvGTD和血细胞凋亡情况的影响。结果显示，LvTLAP干扰后，LvGTD表达量显著性（p<0.05）或极显著性（p<0.01）上升。与之对应，促凋亡基因LvcytochromeC和Lvcaspase3表达量显著性上升（p<0.05），抑凋亡基因LvIAP1表达量显著性下降（p<0.05），同时，LvCaspase3/7活性极显著性升高（p<0.01）。通过流式细胞术检测发现，与对照组相比，干扰LvTLAP后血细胞凋亡比例明显上升。由此推测，LvTLAP可能通过LvGTD负调控血细胞的凋亡而参与对虾对WSSV的免疫防御。
综上所述，本研究在建立一种有效的对虾血浆低丰度蛋白纯化方式的基础之上，首次发现一种新的与对虾抵御WSSV有关的血浆低丰度应激蛋白LvTLAP，其作用机制可能与其通过LvGTD负调控血细胞凋亡有关。所获研究结果对深入阐明对虾免疫防御机制，寻找新的免疫防御靶位具有重要的理论意义和潜在的应用价值，促进我国对虾养殖业的健康、持续发展。
1.对虾血浆低丰度蛋白纯化方法的建立
首先，采用超速离心纯化对虾血浆，发现高丰度蛋白血蓝蛋白（hemocyanin）可沉降于管底。SDS-PAGE分析显示，与对照组相比，超速离心可去除部分血蓝蛋白。同时，低丰度蛋白可得到较好的富集。
继而，采用分子筛凝胶层析（SupersoseTM6increase10/300GL,GEhealthcare,USA）技术对上述去除部分血蓝蛋白的血浆进行进一步分离纯化。结果显示，经分子筛凝胶层析去除血蓝蛋白后的血浆，其低丰度蛋白可得到有效的纯化。
由此说明，超速离心结合分子筛凝胶层析是一种有效的对虾血浆低丰度蛋白纯化方式。
2.WSSV刺激下血浆低丰度应激蛋白的鉴定
首先，采用上述建立的血浆低丰度蛋白纯化方法纯化WSSV刺激后对虾血浆样品，并进行iTRAQ（isobarictagsforrelativeandabsolutequantification）分析。结果发现，与对照组相比，感染WSSV后59个蛋白的表达量发生显著性变化，其中，Unigene31697、Unigene36916、Unigene14284、Unigene22593、Unigene11244、CL15、Unigene23065、Unigene6879、CL2720、CL1742、Unigene29120、Unigene22776、CL6041、Unigene25681、CL7960、CL3059、CL6072和CL7272等18个蛋白表达量显著上调2倍以上。由此提示，这些上调血浆低丰度蛋白可能与对虾响应WSSV应激有关。
继而，采用Real-timePCR分析WSSV刺激对上述质谱鉴定的上调血浆低丰度应激蛋白mRNA表达水平的影响。结果显示，WSSV刺激对虾24h之内，Unigene11244、Unigene36916和CL1742等8个蛋白在mRNA水平有不同程度上调，且变化趋势与iTRAQ结果基本一致，其中，CL1742（命名为LvTLAP）响应最为明显，在8h和24h其mRNA水平分别上调至3.5倍和5.3倍。由此说明，LvTLAP等8个血浆蛋白可能为对虾响应WSSV应激的新的潜在靶位。
3.LvTLAP免疫学功能与作用机制的研究
为进一步研究上述血浆蛋白对WSSV的响应机制，我们选取应激反应最为明显的未知蛋白LvTLAP进行深入研究。
3.1基因克隆、原核表达与抗体制备
采用基因克隆技术获取LvTLAP全长序列，发现其开放阅读框长为1092bp，编码363个氨基酸，理论pI/Mw为5.31/39.02kDa。生物信息学分析发现，LvTLAP含有一个Tryp-SPc结构域（aa118-357）。组织差异性表达分析显示，LvTLAP在各组织中均有表达，其中，在心脏中表达量最高，在鳃中表达量最低。
在上述基础之上，通过原核表达成功获得分子量约为65kDa的rGST-LvTLAP重组蛋白，进一步将重组蛋白免疫小鼠，制备LvTLAP多克隆抗体。Dot-ELISA分析显示，该抗血清能与rGST-LvTLAP发生特异性结合。由此说明，鼠抗LvTLAP抗体制备成功，可用于下一步研究。
3.2免疫相关性分析
首先，通过病原刺激实验分析LvTLAP对不同病原的响应，发现其在蛋白水平可以明显响应副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、海豚链球菌（Streptococcusiniae）和WSSV的刺激，分别在12、48和48h时蛋白表达量最高。其中，LvTLAP对WSSV响应最为明显，其表达呈先下降后上升的趋势，在12h表达量最低，在48h表达量最高，后者为前者表达量的4.86倍。
继而，比较分析敲降LvTLAP前后WSSV刺激下对虾死亡率的变化情况。结果显示，WSSV刺激120h后，与对照组（dsEGFP+WSSV）相比，干扰组（dsLvTLAP+WSSV）死亡率明显上升，存在极显著差异（p<0.01）。
由此说明，LvTLAP可能为对虾一种新的免疫应激相关蛋白，尤其与抵御WSSV感染密切相关。
3.3作用机制探索
首先，在亚克隆、原核表达LvTLAP结构域（aa118-357，命名为LvTLAPD）的基础之上，采用pull-down和MALDI-TOF/MS技术对LvTLAP的相互作用蛋白进行分析。结果发现，rGST-LvTLAPD与对虾血浆总蛋白孵育后，新增2条分子量分别为55kDa和25kDa的差异蛋白条带。经质谱鉴定，这两个蛋白条带分别与putativedyneinheavychain12-axonemal（DNAH12）和growthandtransformation-dependentprotein（GTD）具有高度同源性，推测其可能为LvTLAP的相互作用蛋白。
其次，结合文献相关报道选取GTD作为研究对象，采用基因克隆、原核表达、pull-down和Westernblot等技术深入分析LvTLAP和GTD重组蛋白（rHis-LvGTD）之间的相互作用。结果显示，与对照组相比，rGST-LvTLAPD可与rHis-LvGTD发特异性的结合。由此说明，LvGTD应为LvTLAP的相互作用蛋白。
最后，采用RNA干扰技术分析LvTLAP敲降后对LvGTD和血细胞凋亡情况的影响。结果显示，LvTLAP干扰后，LvGTD表达量显著性（p<0.05）或极显著性（p<0.01）上升。与之对应，促凋亡基因LvcytochromeC和Lvcaspase3表达量显著性上升（p<0.05），抑凋亡基因LvIAP1表达量显著性下降（p<0.05），同时，LvCaspase3/7活性极显著性升高（p<0.01）。通过流式细胞术检测发现，与对照组相比，干扰LvTLAP后血细胞凋亡比例明显上升。由此推测，LvTLAP可能通过LvGTD负调控血细胞的凋亡而参与对虾对WSSV的免疫防御。
综上所述，本研究在建立一种有效的对虾血浆低丰度蛋白纯化方式的基础之上，首次发现一种新的与对虾抵御WSSV有关的血浆低丰度应激蛋白LvTLAP，其作用机制可能与其通过LvGTD负调控血细胞凋亡有关。所获研究结果对深入阐明对虾免疫防御机制，寻找新的免疫防御靶位具有重要的理论意义和潜在的应用价值，促进我国对虾养殖业的健康、持续发展。
3.3作用机制探索
首先，在亚克隆、原核表达LvTLAP结构域（aa118-357，命名为LvTLAPD）的基础之上，采用pull-down和MALDI-TOF/MS技术对LvTLAP的相互作用蛋白进行分析。结果发现，rGST-LvTLAPD与对虾血浆总蛋白孵育后，新增2条分子量分别为55kDa和25kDa的差异蛋白条带。经质谱鉴定，这两个蛋白条带分别与putativedyneinheavychain12-axonemal（DNAH12）和growthandtransformation-dependentprotein（GTD）具有高度同源性，推测其可能为LvTLAP的相互作用蛋白。
其次，结合文献相关报道选取GTD作为研究对象，采用基因克隆、原核表达、pull-down和Westernblot等技术深入分析LvTLAP和GTD重组蛋白（rHis-LvGTD）之间的相互作用。结果显示，与对照组相比，rGST-LvTLAPD可与rHis-LvGTD发特异性的结合。由此说明，LvGTD应为LvTLAP的相互作用蛋白。
最后，采用RNA干扰技术分析LvTLAP敲降后对LvGTD和血细胞凋亡情况的影响。结果显示，LvTLAP干扰后，LvGTD表达量显著性（p<0.05）或极显著性（p<0.01）上升。与之对应，促凋亡基因LvcytochromeC和Lvcaspase3表达量显著性上升（p<0.05），抑凋亡基因LvIAP1表达量显著性下降（p<0.05），同时，LvCaspase3/7活性极显著性升高（p<0.01）。通过流式细胞术检测发现，与对照组相比，干扰LvTLAP后血细胞凋亡比例明显上升。由此推测，LvTLAP可能通过LvGTD负调控血细胞的凋亡而参与对虾对WSSV的免疫防御。
综上所述，本研究在建立一种有效的对虾血浆低丰度蛋白纯化方式的基础之上，首次发现一种新的与对虾抵御WSSV有关的血浆低丰度应激蛋白LvTLAP，其作用机制可能与其通过LvGTD负调控血细胞凋亡有关。所获研究结果对深入阐明对虾免疫防御机制，寻找新的免疫防御靶位具有重要的理论意义和潜在的应用价值，促进我国对虾养殖业的健康、持续发展。