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酵母培养物作为一种极具替代抗生素潜力的产品;具有提高动物生产性能;调节免疫功能、改善胃肠道微生态平衡;保障肠道健康等多种营养保健的功效;在畜牧生产中具有广泛的应用前景。而酵母培养物是特定的培养基经酵母菌发酵技术制得的一种营养丰富、成分复杂微生态发酵产品。多年研究普遍认为;其营养保健作用是通过其发酵代谢产物来实现的;然而酵母培养物所包含的代谢产物种类繁多; 除少数已知的营养物质外;多数是以各种化合物形式存在的安全性未知成分;其主要的或特定的有效作用成分未有确切描述和解释;因此酵母培养物成分中发挥功能的主要活性成分有及其之间的协同作用;是需要进一步研究确证的问题。本文基于以往有关酵母培养物的代谢组学分析方法的建立、多变量统计分析如主成分分析等研究成果研究思想方法、在建立的气相色谱质谱联用的GC-MS 检测方法基础上;针对酵母培养物“有效物组”的探究;开展了系列研究。从而为实现客观、准确、快捷地评价酵母培养物产品品质;科学认识其功能实质提供了重要的研究参考依据。 本论文建立了硅烷化衍生法结合气相色谱 /质谱( GC /MS) 法同时测定差异化培养的酵母培养物中代谢物质的分析方法。以 N;O-双( 三甲基硅烷) 三氟乙酰胺( BSTFA含1%TMCS) 为衍生化试剂;对5个不同发酵时间的酵母培养物的发酵产物、酵母培养物培养基以及达农威益康 VXP 产品进行衍生;并进行GC-MS 测定。通过 NIST11 质谱数据库检索确定;将数据预处理后导入SIMCA-P 软件进行多元统计分析。结果共鉴定出85种物质;主成分分析( PCA)结果显示;酵母培养物样品能较为明显的分开;且呈动态变化趋势。 差异化培养的酵母培养物成分主要为氨基酸、有机酸、酯类、醇类、寡糖类等。此方法适合于酵母培养物的代谢组学研究;为酵母培养物有效物组的探究创造了一个差异的备选空间;也为其有效物组分析提供了物质研究基础。 通过对肉仔鸡生长性能、免疫功能、营养物质利用率、盲肠微生物及代谢等分析;主要根据生产性能优选出在肉仔鸡应用效果最佳的酵母培养物;为酵母培养物有效物组的筛选提供依据。选取336羽健康的、体重相近的1 d AA肉仔鸡;随机分为7个处理组;每个处理6个重复;每个重复8只。对照组(A组)饲喂基础日粮;酵母培养物组(B、C、D、E、F 组)分别在基础日粮中添加发酵时间 12h、24h、36h、48h、60h 的酵母培养物;阳性对照组(G组)添加“达农威益康 V XP”酵母培养物产品;预试期7d;试验期为 42 d。结 果 表 明 :饲粮中添加发酵 24h 培养的酿酒酵母培养物肉仔鸡的平均日增重(ADG)显著提高(P<0.05);且降低了料重比(F/G) (P<0.05) 。试验各处理组的平均日采食量(ADFI)均有提高趋势(P>0.05)。在21 d和42 d;添加发酵24h及36h酿酒酵母培养物组的免疫球蛋白(IgA、IgG)浓度显著高于对照组(P<0.05)。各试验组的免疫器官指数与对照组相比;均有不同程度的提高。42d;添加发酵24h酿酒酵母培养物组的脾脏指数显著高于对照组(P<0.05);比对照组提高了36.19%。对于盲肠挥发性脂肪酸;与对照组相比;在2个日龄阶段;日粮中添加不同发酵时间产出的酵母培养物增加了肉仔鸡盲肠乙酸、丙酸及丁酸含量(P<0.05);且高于XP组(P>0.05)。在21日龄;显著增加了总挥发性脂肪酸的含量(P<0.05 )。在42日龄;总挥发性脂肪酸的含量较对照组与XP组有所增加;但各试验组差异不显著(P>0.05)。综上所述在本试验条件下;以添加发酵24h的酿酒酵母培养物对肉仔鸡的营养保健效果最佳。另外试验利用Illumina Miseq高通量测序技术检测42日龄肉鸡盲肠内容物菌群结构及GC-MS 代谢组学初步分析肉仔鸡盲肠代谢物的变化。结果表明酵母培养物的添加提高了肉仔鸡肠道菌群的丰度。而发酵24h样品中Verrucomicrobia(疣微菌门)含量较其他组显著增加;且Akkermansia“减肥细菌”显著高于其他组。7个处理组肉仔鸡盲肠道内容物进行GC-MS测定;化合物的结构通过 NIST11 数据库检索及对照品指认确定;将数据预处理后导入 SIMCA-P 13.0软件进行多变量分析。结果显示各组在不同时间点均可较好地各自聚类;说明日粮中添加酵母培养物对肉鸡盲肠中代谢产物产生一定影响。经过OPLS-DA筛选出生产性能差异较大的发酵24h与60h的酵母培养物组盲肠主要差异性代谢物为丙氨酸、亮氨酸、苯乙酸、呋喃甘露糖、阿拉伯糖醇、胆固醇。其中发酵24h酵母培养物产品中;丙氨酸、亮氨酸、苯乙酸含量升高;呋喃甘露糖、阿拉伯糖醇、胆固醇含量下降。这些差异代谢物主要涉及以下代谢途径:苯丙氨酸代谢、丙氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢、胆固醇代谢、甾体激素合成脂肪消化和吸收;维生素消化和吸收等。 在本试验条件下;根据生产性能;并结合代谢组学生物标志物筛选方法如OPLS-DA筛选到酵母培养物的生物标志物即有效物组为甘氨酸、果糖、肌醇、吡喃(型)半乳糖、蔗糖。同时建立了生产性能与酵母培养物有效物组的函数关系;从而进一步揭示有效物组的组合配伍与生产性能的关系;为酵母培养物有效物组的确证提供参考依据。 功效验证试验主要是考察酵母培养物有效物组与筛选到生产性能最佳的发酵24h的酵母培养物在肉仔鸡生产性能、免疫功能、抗氧化及屠宰性能指标的比较情况。同时利用高通量测序技术分析它们对肉仔鸡生长早期(7-21日龄)盲肠菌群的影响。 试验采用单因素完全随机分组设计;选取336羽 1 日龄健康体重相近的AA肉仔鸡;公母各半随机分为 7组;每组 6个重复;每个重复 8 只。试验期为 42 d。对照组饲喂基础日粮;酵母培养物有效物组(A、B、C组)分别饲喂在基础日粮基础上添加酵母培养物有效物组的3个不同剂量配伍组合;D组(YC24h)饲喂发酵24h的酵母培养物;E、F组为XP组;分别在基础日粮基础上添加0.1%、1%益康“VXP”饲料添加剂。结果表明:在生产性能上;7~21 日龄;与对照组相比;各添加处理组可显著提高肉仔鸡日增重、显著降低料重比(P<0.05);对日采食量也有显著影响(P<0.05)。其中有效物组(A、B、C组)日增重均大于D组(YC24h)(P>0.05);较D组(YC24h)分别提高1.71%、4.96%和2.69%。而各处理组料重比均显著低于对照(P<0.05);其中以有效物组C的料重比最低。在 7~42 日龄;与对照组相比;各添加组的日增重都显著高于对照组(P<0.05);采食量、料重比均显著低于对照组(P<0.05);但各添加组间差异不显著(P>0.05)。各个处理组间;有效物组C料重比最低;与D组(YC24h)组基本相同。对肉仔鸡血清生化指标影响:21 日龄时;对于血清总蛋白、白蛋白;血清球蛋白各试验处理组含量较对照组均有所提高;但差异并不显著(P<0.05)。对于谷草转氨酶;有效物组A、B含量显著小于对照组(P<0.05);对于碱性磷酸酶;各试验处理组含量均高于对照组;其中有效物组 C 含量显著高于对照组与 XP 组(P<0.05)。对于血清尿素氮;有效物组(ABC)含量均显著低于对照组(P<0.05)。对于血清尿素氮;有效物组C与E、F组(XP组)含量显著低于对照组(P<0.05);其中以E组最低;C组次之。有效物组(ABC)与D组(YC 24h)比较无显著差异(P>0.05)。在肉仔鸡免疫功能方面:在42日龄时;各添加处理组胸腺指数较对照组呈增加趋势;但并不显著(P>0.05)。21日龄时;有效物组C的IgG含量显著高于对照组(P<0.05)。42日龄时;有效物组 B 中 IgA、IgG 的含量均显著高于对照组(P<0.05)。21 日龄肉仔鸡;有效物组B血清中MDA的含量低于对照组与XP(EF)组;且有效物组B血清中的 MDA 含量最低;比对照组降低了 62.27%(P>0.05)。对于 42 日龄肉仔鸡;与对照组相比;各添加处理组血清中GPX ;SOD和 CAT 活性均有不同程度的提高;而血清中 MDA 的含量较对照组略有升高;但影响作用不明显(P>0.05。对肉仔鸡屠宰性能的影响:与对照组相比;各处理组对42d肉仔鸡屠宰率、全净膛屠宰率、胸肌率、腿肌率无显著影响(P>0.05);但有一定的升高趋势。 试验还考察了酵母培养物有效物组对肉仔鸡早期盲肠菌群的结构和组成的影响。结果表明;不同试验添加处理肉鸡肠道菌群结构变化影响较大。饲养前期酵母培养物的添加显著改变肉鸡盲肠菌群结构;而有效物组(ABC)与D(YC24h)组比较菌群结构改变不显著。综上;通过有效物组的动物饲养验证试验;初步确 认酵母培养物有效物组成分为甘氨酸、果糖、肌醇、半乳糖以及蔗糖。