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糖胺聚糖(GAGs)是由己糖醛酸和己糖胺组成的重复二糖单元构成的线性长链大分子。透明质酸(HA)和硫酸软骨素(CS)是人体内两种常见的糖胺聚糖,主要存在于哺乳动物结缔组织的细胞外基质中,是体内重要的炎症反应和免疫响应调节因子。随着年龄的增长,HA和CS在人体内会失去乙酰基变成两性离子化糖胺聚糖。乙酰化-去乙酰化等结构修饰是机体调控生物大分子生理功能的重要手段。目前尚不清楚这种年龄引起的糖胺聚糖去乙酰化现象有着怎样的生物学意义。基于以上研究背景,我们进行了以下研究:1.去乙酰化透明质酸吸湿保湿能力评价。首先通过肼解的方法制备了两种去乙酰化透明质酸(dHAs)。高效凝胶色谱测得分子量分别为24 kDa和16 kDa,1H-NMR积分法计算得到去乙酰化度分别为79.4%和93%。进一步测定了这两种去乙酰化透明质酸在81%或者43%湿度条件下的吸湿能力,以及在干燥环境或者43%湿度条件下的保湿能力。结果显示:去乙酰化透明质酸的吸湿和保湿能力都远远低于其对应分子量的再乙酰化透明质酸。圆二色谱的结果显示去乙酰化透明质酸吸湿保湿能力的下降是因为其所含的不溶解酰胺与水分子相互作用非常弱。这些结果暗示:皮肤的自然老化,例如松弛、下垂、皱纹等临床表现,除了和老年人皮肤中透明质酸含量减少有关,还与年龄增长引起的透明质酸N-去乙酰化现象相关。2.去乙酰化透明质酸免疫响应能力的变化和机制研究。调整肼解条件,得到三种不同分子量的去乙酰化透明质酸,分别命名为dHA-5 kDa(Mw:5 kDa,去乙酰化度:100%),dHA-16 kDa(Mw:16 kDa,去乙酰化度:94%),dHA-110 kDa(Mw:110 kDa,去乙酰化度:72%)。首先比较了这三种去乙酰化透明质酸与其对应的再乙酰化透明质酸激活抗原呈递细胞(APC)的能力。结果表明透明质酸与去乙酰化透明质酸都具有激活抗原呈递细胞的能力,其中去乙酰化透明质酸对抗原呈递细胞的激活能力明显低于透明质酸。进一步研究显示,其主要作用机制都是通过TLR/MyD88依赖的途径激活核转录因子NF-κB,进而诱导细胞产生炎症因子,但与透明质酸相比较,去乙酰化透明质酸激活抗原呈递细胞更依赖于TLR2途径。因此,我们的研究表明去乙酰化可以引起透明质酸在免疫应答方面的变化,暗示着年龄引发的内源性糖胺聚糖功能变化可能和其在体内的结构修饰有关。3.去乙酰化透明质酸促脾细胞和T,B细胞增殖作用的研究。我们用dHA-110 kDa和HA-120 kDa进行了脾细胞和T,B细胞增殖作用的研究。结果表明,HA-120 kDa和dHA-110 kDa都能够促进脾细胞增殖,而且能够协同伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激T细胞的增殖,协同脂多糖(LPS)刺激B细胞的增殖。HA-120 kDa促进脾细胞增殖主要依赖于TLR4途径,而两性离子化透明质酸dHA-110 kDa更多的依赖于TLR2途径来促进脾细胞增殖。用流式细胞仪检测HA-120 kDa和dHA-110 kDa对CD3e抗体标记的T细胞和CD19抗体标记的B细胞的增殖作用。结果显示:HA-120 k Da和dHA-110 kDa能够促进T细胞增殖,且作用相当;HA-120 kDa和dHA-110 kDa能够促进CD4+T和CD19+B细胞增殖,且dHA-110 kDa的促增殖作用明显强于HA-120 kDa。这些结果提示,体内T,B免疫调节细胞免疫作用的变化也可能与透明质酸的去乙酰化现象相关。4.硫酸软骨素A及其两性离子化衍生物的免疫活性及其机制研究。作为组织胞外基质的重要组成成分,硫酸软骨素A已经被证明具有促炎或者抗炎的免疫调节活性,并且调节作用很大程度上取决于其分子量大小和所作用免疫细胞的类型。在本研究中,我们主要比较了硫酸软骨素(CS-A)及其N-去乙酰化产物(dCS-A)的免疫激活作用及信号通路。结果显示:CS-A和dCS-A都能够激活抗原呈递细胞中的NF-κB核转录因子并通过TLR/MyD88途径诱导TNF-α细胞因子的分泌。进一步研究表明,CS-A和dCS-A都能够促进小鼠脾淋巴细胞增殖,诱导卵清蛋白(OVA)致敏的脾细胞释放细胞因子。这些研究使我们对CS-A和dCS-A细胞的免疫调节作用有了更深入的理解,可能有助于开发基于硫酸软骨素的免疫调节剂来对付慢性炎症、自身免疫、传染病、过敏和哮喘等疾病。综上所述,本研究对揭示内源性糖胺聚糖去乙酰化修饰所产生的免疫效应具有重要的意义,同时也拓宽了两性离子多糖的研究范畴,有助于发现新的具有免疫活性的两性离子多糖。