本研究主要由三个部分组成:第一部分是文献综述,包括高尿酸血症中西医治疗进展以及网络药理学的研究进展两部分;第二部分是网络药理学部分:网络药理学预测自拟痛风方治疗高尿酸血症的作用机制;第三部分是实验研究:自拟痛风方对高尿酸血症湿热蕴结证大鼠模型的机制探索。现将本研究的目的、方法、结果、结论分别介绍如下。目的:本研究通过网络药理与动物实验研究两部分就自拟痛风方对高尿酸血症湿热蕴结证的作用机制进行探索。先通过网络药理学预测自拟痛风方作用于高尿酸血症的靶标和通路,阐释其可能的作用机制。再通过观察自拟痛风方治疗高尿酸血症湿热蕴结证大鼠模型的疗效,进一步验证,阐释其作用机制,为临床的运用及推广提供证据支持,也为中医药治疗高尿酸血症和中药的开发提供思路。方法:网络药理学部分:1.高尿酸血症的靶标的收集分别通过TTD数据库、Drugbank数据库、Ctd base数据库检索收集高尿酸血症的靶标,将三者收集的靶标整合去除重复项,通过Uniprot数据库统一规范,最终得到高尿酸血症的相关靶标。2.自拟痛风方的成分收集自拟痛风方主要由葛根、金钱草、防己、车前子、金银花五味药组成,从TCMDatabase@Taiwan台湾中医药数据库分别获得五味药的化学成分。然后从PubChem compound数据库获取各化学成分的SMILE格式,若查询不到,则用Chemdraw软件代替获取。3.自拟痛风方的靶标预测将各中药化学成分的SMILE格式通过SuperPred webserver网站查询,得到各成分的预测靶标。同样将其通过Uniprot网站统一规范靶标名称。4.网络构建与分析将整合对接后的高尿酸血症相关靶标及中药靶标导入Cytoscape3.6.0软件构建“成分-靶标”网络图,进行可视化分析,并将整合对接后的靶标导入Clue GO插件进行关键靶标的基因功能与代谢通路分析。实验研究部分:健康清洁级10周左右Wistar大鼠72只,采用随机数字表法将其分为正常对照组(蒸馏水1ml/100g)、模型组(蒸馏水1ml/100g)、痛风方低剂量组(0.293g颗粒剂/kg)、痛风方中剂量组(0.585g颗粒剂/kg)、痛风方高剂量组(1.170g颗粒剂/kg)、苯溴马隆组(4.5mg/kg)共六组,每组各12只。正常对照组予普通饲料喂养,自由饮用蒸馏水,其余各组均以高脂高糖饲料喂养,予200g/L蜂蜜水自由饮用。除正常对照组外,其余各组分别以油脂(1g/100g)和52%红星二锅头(1ml/100g)交替联合灌胃10天。第11天,正常对照组加灌10ml/kg蒸馏水。其余各组加灌等量的鼠伤寒沙门氏菌液。120h后(第16天)加强一次,正常对照组加灌5ml/kg蒸馏水,其余各组加灌等量鼠伤寒沙门氏菌液。期间造模方法与前相同。同时,第11天一并开始药物灌胃7天。第18天,除正常对照组外,其余各组腹腔注射氧嗪酸钾300mg/Kg,正常对照组腹腔注射等容积生理盐水,制备高尿酸血症湿热蕴结证模型。第18天,大鼠禁食12小时后,麻醉后剖开腹腔,腹主动脉取血,分离肾脏组织送检。测定大鼠血清XOD、肝功(ALT、AST)、肾功(UA、SCr、BUN)、血脂(TG、CHO、LDL-C、HDL-C)、肾脏组织 HE染色、肾脏组织URAT1、ABCG2免疫组化。结果:网络药理学部分:自拟痛风方五味药中金银花作用于疾病的靶标最多,有效化学成分29个,作用于12个靶标,葛根有效化学成分4个,作用于10个靶标,车前子有效化学成分4个,作用于9个靶标,防己有效化学成分2个,作用于1个靶标,金钱草无对接靶标。自拟痛风方共34个有效化学成分,作用于高尿酸血症12个靶标:CYP2D6、CYP3A4、PPARG、XDH、ABCG2、CYP1A1、CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9、AOX1、UGT1A9、CYP2C8。其中 XDH、ABCG2、PPARG 与高尿酸血症关系紧密。自拟痛风方的预测靶标主要参与以下3条代谢通路的调控,包括药物代谢;异型生物质、有害物质的排出;花生四烯酸的代谢过程。实验研究部分:造模后模型组大鼠血清UA、血清XOD升高,毛发疏松、粗糙,嗜睡倦怠,小便黄,阴囊松弛下垂,大便溏泻或粘腻加重,肛周污秽,肛温升高提示高尿酸血症湿热蕴结证造模成功。造模后,除正常对照组外,各组血清AST、ALT均出现不同程度升高,差异具有统计学意义(P<0.05),提示此造模方法可能影响肝功,考虑为鼠伤寒沙门氏菌及白酒引起,提示造模方法需进一步改良。造模后各组SCr无明显差异(P>0.05),除正常对照组外,各组BUN均出现不同程度下降,提示造模方法对肾功能无损伤。造模后,除正常对照组外,各组血清CHO、TG、LDL-C均出现不同程度升高,差异具有统计学意义(P<0.05),考虑为高脂高糖饲料喂养及油脂灌服引起。与模型组相比,苯溴马隆组与痛风方高剂量组血清UA均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),其中以痛风方高剂量组降低最明显,说明苯溴马隆及痛风方高剂量组均能有效降尿酸,其中高剂量痛风方降尿酸效果最优。除正常对照组外,其余各组血清XOD活性表达无明显差异,差异不具有统计学意义(P>0.05),暂不能提示苯溴马隆及痛风方可通过抑制XOD活性抑制尿酸生成。肾脏组织HE染色提示各组大鼠肾组织细胞形态正常,未见明显病理改变,提示此造模方法、西药及中药对肾脏均无明显损伤。肾脏组织免疫组化提示URAT1在正常对照组表达最少,痛风方高剂量组、苯溴马隆组较少,痛风方低、中剂量组较多,在模型组的表达最多。因URAT1属于尿酸重吸收蛋白,其表达越少,证明尿酸重吸收越少,则血尿酸越低,提示自拟痛风方及苯溴马隆能够通过抑制URAT1的表达,从而抑制尿酸重吸收达到降低血尿酸的作用,其中痛风方高剂量组与苯溴马隆组表达量相当,提示高剂量痛风方与苯溴马隆抑制URAT1疗效相当。ABCG2在正常对照组表达最多,痛风方高剂量组次之,痛风方中剂量组较多,痛风方低剂量组、苯溴马隆组及模型组表达最少。因ABCG2属于尿酸分泌蛋白,其表达越多,越能促进尿酸从肾小管分泌排出,则血尿酸越低。提示苯溴马隆无增加ABCG2表达的作用,而痛风方可通过加强ABCG2的表达,促进尿酸的分泌排出,达到降低血尿酸的作用,其中以高剂量痛风方效果最优。生化指标方面,与模型组相比,痛风方中剂量组血清HDL-C较模型组升高,差异具有统计学意义(P<0.05),提示自拟痛风方可能有调节血脂的疗效;痛风方高剂量组血清AST较模型组降低,差异具有统计学意义(P<0.05),提示高剂量痛风方能够降低血清AST,具有一定护肝作用。结论:网络药理学提示自拟痛风方治疗高尿酸血症具有多成分、多靶点的作用,主要通过作用于XDH、ABCG2、PPARG等靶标,影响花生四烯酸的代谢起到降尿酸、抗炎,预防痛风发作的作用。动物实验提示自拟痛风方具备良好的安全性,能够有效降低血尿酸水平,其机制可能主要是通过上调ABCG2、下调URAT1的表达以促进尿酸排泄,达到降尿酸作用。