具有脑肿瘤靶向和肿瘤组织穿透能力的CendR多肽及其基因递释系统的研究

来源 :复旦大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chengqiantu
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胶质瘤是最为常见的脑部肿瘤,约占脑肿瘤发病数的40%,患者的五年生存率低于10%。目前,脑胶质瘤的临床治疗主要采用手术切除、放疗和化疗相结合的综合方案。由于胶质瘤细胞呈浸润性生长,与周围正常脑组织边界不清,外科手术不能完全切除肿瘤组织,术后易复发;放射治疗副作用大,易导致放射性痴呆。因此,药物治疗策略的研究对脑胶质瘤而言是非常重要的。脑胶质瘤在发生早期,血脑屏障比较完整,普通给药系统难以穿越;中后期时,肿瘤区域形成血管,血脑屏障遭到破坏,此时构建药物递释系统跨越血脑瓣瘤屏障对于成功治疗脑肿瘤尤为重要。研究显示,肿瘤细胞上表达的特异性受体是肿瘤靶向递药的有效靶点,具有肿瘤特异性寻靶分子介导的肿瘤靶向治疗是一种有效克服血脑肿瘤屏障的手段,有助于提高肿瘤治疗效果。  C末端规则多肽(CendR多肽),是通过噬菌体技术发现的,由R/KXXR/K氨基酸序列构成的一系列 L构型多肽,能够与靶细胞表面神经纤毛蛋白-1(Neuropilin-1,NRP-1)受体结合,具有脑肿瘤细胞靶向性和肿瘤组织穿透能力的双重作用。本课题选择一条序列为RGERPPR的L构型CendR多肽作为寻靶分子。研究表明L-构型多肽进入血液后,易被血浆中的蛋白酶所降解,从而丧失寻靶能力。为了增强L构型多肽的体内稳定性,并进一步提高其肿瘤靶向能力,本课题同时根据逆序翻转D构型理论设计了D构型多肽D(RPPREGR)。进而考察二者生物稳定性和生物活性,并将RGERPPR和D(RPPREGR)作为穿过血脑肿瘤屏障的靶向分子,修饰于聚乙二醇一聚乙烯亚胺上构建非病毒基因给药系统,考察其能否将治疗基因递送到脑部肿瘤,以期达到靶向治疗脑原位胶质瘤的目的。  鉴于课题的上述设计,本论文共分为四个章节:  第一章多肽稳定性和靶向性考察  通过多肽固相合成法合成了一系列CendR多肽:RGERPPR,D(RPPREGR),CRGERPPR和D(CRPPREGR)。HPLC检测及MS鉴定表明其纯度均高于95%。与RGERPPR进行比较,D(RPPREGR)具有良好的血浆稳定性,弥补了RGERPPR作为寻靶分子在血浆中易酶解的缺点。并且,与原型RGERPPR相比,逆序D(RPPREGR)不仅能够提高对U87细胞的摄取能力,还能够增强对肿瘤组织的穿透能力,二者均有利于提高药物递释系统在靶部位的聚集,提高疗效。  第二章载体材料/基因复合物的制备与表征  本章合成了mPEG-PEI、RGERPPR-PEG-PEI和D(RPPREGR)-PEG-PEI非病毒基因载体材料,通过1H-NMR图谱分别对其进行了表征,并通过计算得出其实际接枝比分别为4.3∶1、4.4∶1及4.2∶1,与理论接枝比基本相符。  制备了 PEI/pGL4.2、 mPEG-PEI/pGL4.2、 RGERPPR-PEG-PEI/pGL4.2和D(RPPREGR)-PEG-PE/pGL4.2复合物并对其进行了表征。琼脂糖凝胶电泳结果表明,在N/P≥4时,载体PEI、 mPEG-PEI、RGERPPR-PEG-PEI和D(RPPREGR)-PEG-PEI与pGL4.2形成纳米复合物后能够完全包载DNA,具有良好的稳定性。随着N/P从4增加到16,三组复合物粒径均不断减小,电位均不断增加。在相同N/P比,PEI组电位和粒径均最大。由于PEG的修饰,mPEG-PEI/pGL4.2、RGERPPR-PEG-PEI/pGL4.2和D(RPPREGR)-PEG-PEI/pGL4.2组的粒径和电位均减小。  第三章体外细胞学评价  细胞摄取和肿瘤球穿透能力评价实验表明:CendR多肽修饰不仅能增加U87细胞对基因复合物的摄取能力,还能够提高复合物对肿瘤组织的穿透能力,二者均有利于提高基因递释系统在体内转染效率;且L构型多肽RGERPPR与逆序D构型多肽D(RPPREGR)修饰作用相当。MTT试验结果表明:PEG化的PEI细胞毒性显著低于PEI,细胞存活率均在80%以上。绿色荧光蛋白转染实验、虫荧光素酶转染实验和肿瘤球转染实验表明:L构型多肽RGERPPR和逆序D构型多肽D(RPPREGR)修饰能提高了PEG-PEI的体外U87细胞转染效率,且RGERPPR与D(RPPREGR)修饰作用相当。细胞凋亡实验表明:CendR多肽修饰能提高PEG-PEI的体外U87细胞凋亡率,且RGERPPR与D(RPPREGR)修饰作用相当。  第四章体内药效学评价  脑组织荧光成像和冷冻切片数据表明:RGERPPR和D(RPPREGR)修饰均可以提高原位脑胶质瘤模型裸鼠的体内转染效率,且D(RPPREGR)修饰作用优于RGERPPR;体内药效学实验结果表明:RGERPPR-PEG-PEI、D(RPPREGR)-PEG-PEI分别包载治疗基因pORF-hTRAI,原位神经胶质瘤模型鼠的生存时间从25天分别延长到27天、30天,其中D(RPPREGR)修饰抗肿瘤作用显著性增强(n=13,**P<0.01,log-rank analysis)。与 RGERPPR-PEG-PEI比较,D(RPPREGR)-PEG-PEI是一种有发展潜力的脑肿瘤治疗基因载体。
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