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目的研究mi R-21促进脐带血间充质干细胞(umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells,UCBMSCs)血管向分化的作用,观察mi R-21过表达UCBMSCs在裸鼠下肢缺血模型中的血管再生效果。方法1.UCBMSCs(来源于同济大学干细胞库)培养,并通过诱导UCBMSCs成骨、成脂以及成软骨方向分化的作用,鉴定其多向分化潜能的干细胞特征;2.构建Lenti-Lacz-Luciferase和Lenti-mi R-21-Luciferase慢病毒载体,并测定其MOI值,慢病毒转染UCBMSCs后第4 d,D-荧光素钾处理细胞,通过体外生物发光成像技术(Bioluminescence Imaging,BLI)检测Luciferase表达情况,检测转染效率;3.在目的基因转染UCBMSCs后的0、1、4、7、14及28 d分别采用实时荧光定量PCR及Western Blot检测目的基因及关键成血管因子的表达;4.第3代UCBMSCs分别转染Lenti-Lacz-Luciferase和Lenti-mi R-21-Luciferase后,接种于含有Matrigel的96孔板中,分别于接种后4h至48h在显微镜下观察其tube结构形成情况,并采用Olympus Cell R imaging软件定量分析tube结构长度;5.通过结扎裸鼠股动脉及腘动脉建立下肢重度缺血(Critical limb ischemia,CLI)模型,并将UCBMSCs/mi R-21、UCBMSCs/Lacz及生理盐水各100μL分别注入臀大肌和腓肠肌,在1、4、7、14及28 d,利用热成像技术示踪移植细胞位置,激光多普勒彩超检测其血管灌注量情况。28 d获取标本,在microfil下肢血管灌注后,取臀大肌和腓肠,4%多聚甲醛固定,脱水、石蜡包埋、切片做HE以及CD31免疫荧光染色,检测新血管形成情况。结果1.UCMSCs在成骨诱导后第28天ARS染色中出现钙结节,成软骨诱导后的第16天阿辛蓝染色,成脂诱导后的第16天油红O染色均出现阳性表达,说明UCBMSCs具有多向分化能力的干细胞特性;2.慢病毒载体构建成功,其转染效率可达90%以上;3.q PCR结果表明,mi R-21组的HIF-1α和VEGF在第4天开始显著高表达,并持续到7 d和14 d。其它关键成血管因子,SDF-1、b FGF、PLGF及SCF也表现出与HIF-1α和VEGF相同趋势。Western Blot结果与q PCR结果相似;4.Matrigel结果显示在平行的三组实验中,Lenti-mi R-21-Luciferase组tube结构最多,且长度最长;5.BLI检测显示植入CLI区域的干细胞保持在植入区并未发现转移现象,荧光在第3天表达最高,并持续到第28天。激光多普勒彩超显示CLI区域血管在术后第3天,实验组的血管再生显著优于对照组,这种结果一直持续到术后28d。免疫荧光检测发现实验组CD31表达量高于Lacz组(3倍)及生理盐水组(20倍),这一结果与前期多普勒观察结果一致。结论mi R-21具有促进UCBMSCs血管向分化的作用,并对CLI有一定的治疗效果。