论文部分内容阅读
研究背景与目的端粒(Telomeres)由富含鸟嘌呤(G)的重复序列组成,并与一种称为端粒蛋白复合体(Shelterin)的保护性蛋白复合物结合,定位于真核生物染色体的末端,以保护真核生物染色体的线性末端不被降解和融合,从而起到保护染色体基因组稳定性的作用。端粒酶(Telomerase)是一种核糖核酸聚合酶,在端粒合成中起着关键作用。端粒酶在染色体末端添加重复端粒,以弥补DNA复制过程中端粒序列的丢失。端粒酶除了是调节衰老的关键因子外,其也与癌症发生发展等众多生物学过程密切相关。端粒酶全酶由蛋白质催化亚基TERT和RNA亚基TERC组成。端粒酶RNA组件(Telomerase RNA component,TERC)作为端粒酶全酶的非编码RNA模板和基础骨架,对调节端粒酶活性和端粒酶全酶的组装具有重要意义。经过几十年的研究,人们对TERC基因结构和功能的认识逐渐加深,目前TERC基因被确认为长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)的一员,TERC基因除充当端粒酶模板外,TERC还发挥着与端粒酶无关的其它一些重要的生物学功能。因此,为深入研究TERC基因生物学功能,构建TERC基因敲除动物显得尤为必要。研究方法:由于之前的研究中构建的mTR-/-小鼠模型使用的是传统的基因同源重组和胚胎干细胞技术为基础的基因敲除技术,其方法具有效率低,成本高,构建时间长等缺点。因此,本项目拟采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对大鼠TERC基因进行敲除,以期快速获得TERC基因敲除大鼠,以用于后续相关研究。本课题首先根据大鼠TERC基因序列设计三条sgRNA(single-guide RNA),多位点打靶以能造成基因大片段缺失。接着,将CRISPR/Cas9系统的重要组件Cas9 mRNA和三条sgRNA显微注射入大鼠单细胞受精卵的胞质内,以期望最终获得TERC基因敲除大鼠。结果:1.Cas9 mRNA 与 sgRNAs 制备打开 ensemble 网站(http://asia.ensembl.org/index.html),查询大鼠 TERC基因序列。大鼠TERC基因编号为ENSRNOT00000084300.1,基因长度为420bp,位于第2号染色体上,属于长链非编码RNA。针对大鼠TERC基因设计三条sgRNA,依据基因序列先后位置,分别命名为sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3。接着将以测序比对结果正确的质粒pGU6-sgRNA为模板,PCR扩增和纯化后获得sgRNA体外转录用模板。最后,基于sgRNA体外转录模板,使用体外转录试剂盒体外转录和纯化获得sgRNA。Cas9表达载体经限制性内切酶Age I酶切线性化后,用T7 Ultra Kit以线性化产物为模板进行体外转录,转录所得的Cas9 mRNA通过苯酚/氯仿/异丙醇抽提——乙醇沉淀法纯化,从而纯化后的Cas9 mRNA。2.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备TERC基因敲除大鼠将如上纯化后的Cas9 mRNA和三条sgRNA显微注射入大鼠单细胞受精卵的胞质内,本部分研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得TERC基因大片段缺失的嵌合体大鼠(F0);F0代的TERC基因大片段缺失的嵌合体大鼠与野生型大鼠交配,获得F1的TERC+/-杂合子大鼠,基因型鉴定结果显示大鼠基因型出现分离;接着根据F1代基因型鉴定结果,将基因型相同的TERC+/-大鼠公母间交配,从F2代个体中获得纯合TERC-/-大鼠(G1)。纯合TERC-/-大鼠可育,同时基因修饰能够稳定遗传至后代。可见,TERC基因敲除大鼠成功构建。3.TERC基因敲除大鼠生物学特性分析端粒酶活性检测显示,TERC-/-大鼠胚胎成纤维细胞不具有端粒酶活性。TERC-/-大鼠和WT大鼠的主要脏器质量和组织学等进行比较分析发现,各脏器质量、外观和组织学均无明显差异。以上数据预示,TERC敲除对如上各脏器质量、外观和组织学均无显著影响。结论:成功利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得TERC基因敲除大鼠,同时证实无脱靶效应。TERC-/-大鼠胚胎成纤维细胞中端粒酶失活,纯化TERC基因敲除大鼠主要脏器质量、外观和组织学与野生型大鼠的比较无明显差异。